Un dispositif microfluidique pour quantifier chimiotactisme des bactéries dans des gradients de concentration stable

Summary

Ce protocole décrit le développement d'un dispositif microfluidique pour étudier la chimiotaxie bactérienne dans des gradients de concentration stable de chemoeffectors.

Abstract

Chimiotactisme permet aux bactéries de l'approche des sources de produits chimiques attractives ou pour éviter les sources de produits chimiques répulsifs. Bactéries surveiller en permanence la concentration de chemoeffectors spécifiques en comparant la concentration actuelle à la concentration détectée quelques secondes plus tôt. Cette comparaison permet de déterminer le sens net de mouvement. Bien que plusieurs gradients concurrentes coexistent souvent dans la nature, les approches conventionnelles d'enquêter sur le chimiotactisme des bactéries ne sont pas optimales pour quantifier la migration en réponse aux gradients de concentration d'attractifs et répulsifs. Ici, nous décrivons le développement d'un modèle de chimiotactisme microfluidique pour présenter des gradients de concentration précis et stable des chemoeffectors aux bactéries et quantitativement enquêter sur leur réponse au gradient appliqué. L'appareil est polyvalent dans ce gradients de concentration de toute concentration désirée et la force absolue du gradient peuvent être facilement générés par le mélange diffusif. L'appareil est démontré en utilisant la réponse de

Protocol

1. La fabrication des maîtres de silicium en utilisant la norme SU-8 photolithographie ¹ (non représenté dans cette vidéo).

1. Utilisez du papier standard SU-8 méthodes photolithographie pour créer un SU-8 "maître" (SU-8 2025, MicroChem, Newton, MA) pour la fabrication du moule de PDMS qui contient le réseau microfluidique et la chambre de chimiotactisme. Ces moules maître peut être fabriqué dans toute installation de microfabrication (par exemple, Stanford Microfluidique Fonderie; http://thebigone.stanford.edu/foundry/ ).
2. Avant de réplication PDMS, exposer le SU-8 maître à fluorosilane vapeur dans un dessiccateur attaché à une source de vide pour faciliter la libération facile de PDMS par le maître. Ajouter une goutte de fluorosilane d'une serviette en papier et appliquer le vide pendant une minute. Retirez le vide et laissez 30 min pour le dépôt de fluorosilane. Gardez le SU-8 de maître dans un récipient fermé pour une utilisation future.

2. Réplique de moulage de PDMS de SU-8 maître: La couche fluidique et la couche de contrôle sont réalisés par moulage réplique de PDMS de SU-8 maître.

1. Mélanger le PDMS pré-polymère et cross-linker à un poids de 10h01. Ratio et dégazer dans un dessiccateur pendant 1 heure (ou jusqu'à ce que les bulles d'air sont éliminés du mélange PDMS).
2. Placez le SU-8 maître dans une boîte de Pétri et verser délicatement le mélange PDMS sur le dessus de la SU-8 master à l'épaisseur souhaitée.
3. Chauffer la boîte de Pétri contenant le PDMS et le SU-8 moule maître à 80 ° C pendant deux heures pour guérir le PDMS.
4. Retirez le guérir PDMS-couverte SU-8 maîtres de la plaque de cuisson, éplucher les moisissures PDMS de la SU-8 maître. La structure désirée sera intégré dans le moule PDMS.
5. Percez des trous dans le moule PDMS pour les tubes du générateur de gradient et l'entrée des cellules en utilisant un calibre 20 à bout émoussé aiguille.

3. Collage de dispositifs de PDMS:

1. Nettoyer une lame de microscope en verre avec de l'isopropanol et sec à l'azote ou un courant d'air.
2. Exposez le PDMS et lame de verre pour un plasma d'oxygène dans un Asher plasma.
3. Apportez le moule PDMS en contact avec la lame de verre. Chauffer la lame contacté et le moule PDMS à 65 ° C pendant 15 min.

4. L'assemblage du dispositif de PDMS

1. En utilisant une lame de rasoir, couper des tubes à un angle de 45 ° à la bonne longueur requise pour le périphérique.
2. Insérez une extrémité du tube dans les trous percés dans l'appareil (par exemple, sortie) en utilisant une pince.
3. En utilisant une pince, insérez un émoussé 30 aiguille de calibre dans l'autre extrémité du tube.
4. Répétez l'étape 4.2 pour tous les trous restants.
5. Recueillir 1ml de tampon de chimiotactisme (CB) dans une seringue de 3 ml, en prenant soin d'enlever les bulles d'air de la seringue.
6. Correction d'un manchon de l'aiguille à une extrémité de la tubulure de sortie.
7. Ajouter CB à l'embout de l'aiguille, et appuyez sur l'embout de l'aiguille pour enlever les bulles d'air.
8. Poussez un peu CB de la pointe de la seringue et raccorder la seringue 3 mL à l'embout de l'aiguille, sans piégeage de l'air.
9. Poussez CB à travers le dispositif jusqu'à ce que tous hubs aiguilles restantes sont remplies avec des CB. Cela devrait éliminer la majorité des bulles d'air.
10. Remplir deux seringues 500μL avec CB contenant les concentrations appropriées de l'chemoeffector testé. Éliminer la formation de bulles d'air en poussant une petite goutte de contenu de la seringue et touchant la chute du liquide dans le moyeu de seringues et attachant.
11. De même, connectez une seringue contenant CB à l'entrée des bactéries. Ce sera retirée lorsque les bactéries sont introduites dans le dispositif.

5. La croissance des très mobiles E. coli

1. Cultivez cultures d'une nuit de E. coli RP437 avec une expression de la GFP plasmide dans 20 ml de bouillon de tryptone (TB) à 32 ° C avec agitation. Ajouter des concentrations appropriées d'antibiotiques pour maintenir le plasmide. Dans notre protocole, nous utilisons un pCM182 faible nombre de copies de plasmide pour détecter des bactéries basée sur la fluorescence dans l'appareil. Pour E. coli, les cultures en croissance à 32 ° C est recommandée pour la motilité élevée, que la motilité est inférieur à des températures élevées.
2. Utilisez la culture de la nuit pour inoculer une culture de 20 mL de la tuberculose dans un erlenmeyer de 250 ml pour une densité optique à 600nm de ~ 0,05. Cultiver la culture avec agitation à 32 ° C.
3. Récolter les cellules à une DO ₆₀₀ de ~ 0,35 0,45 par centrifugation à basse vitesse à 400 xg pendant 5 min.
4. Resuspendre les cellules d'une DO ₆₀₀ de ~ 0,35 en CB contenant les chemoeffector à la concentration attendue dans le milieu du chenal.
5. Ajouter DP marqué les cellules mortes à une DO ₆₀₀ de ~ 0,35 dans les cellules exprimant la GFP en direct. Les morts (rouge), les cellules sont utilisées comme contrôle interne pour s'assurer que toute migration n'est pas due aux effets de flux.

6. Chimiotactisme surveillance

1. Retirez une partie de la CB de l'aiguille d'entrée de cellulemoyeu. Remplir avec la suspension cellulaire.
2. Doucement remplir la seringue 50 pl avec les cellules en suspension. Cette étape doit être fait lentement que les flagelles peuvent être cisaillées et permettra de réduire la motilité.
3. Fixer la seringue 50 pl au hub d'entrée-aiguille comme décrit dans l'étape étapes 4.10.
4. Placez l'appareil sur la scène d'un microscope à fluorescence équipé d'une caméra à haute vitesse d'acquisition d'images. Placez les seringues d'entrée (à la fois les 500 seringues gradient ul et la seringue de 50 uL de cellules) dans la seringue et d'initier des flux tels que le gradient est formé et les cellules sont coule à travers le tube.
5. Une fois que les cellules entrent dans la chambre chimiotactisme, attendez environ 20 minutes pour le système de se stabiliser avant d'imagerie.
6. Recueillir verts (vivants) et rouges (mort) des images de fluorescence à différents endroits le long de la longueur de la chambre (correspondant à différents temps d'exposition). Généralement, nous recueillons de 100 images à chaque endroit, à intervalles 3 sec.

7. Analyse des données: Les étapes suivantes peuvent être effectuées en utilisant un logiciel de retouche disponibles dans le commerce d'analyse (par exemple, ImageJ, Metamorph) ou en utilisant des codes simple écrit en Matlab.

1. Enlever les pixels du fond dans l'image (par exemple, l'intensité des pixels seuil fixé et enlever tous les pixels qui ont l'intensité inférieure au seuil). Ce bruit minimise dans l'analyse.
2. Utilisez la position des cellules mortes (fluorescence rouge) pour déterminer le centre de l'image. Puisque les cellules mortes ne montrent pas de chimiotactisme, cela représente la position où les cellules entra dans la chambre chimiotactisme et serait détectée en l'absence de toute migration.
3. Localisez des cellules vivantes (fluorescence verte) dans l'image.
4. Diviser l'image en canaux et déterminer le nombre de cellules vivantes dans chaque canal. Dans notre travail avant ^3, la gamme 1050 um chimiotactisme chambre a été divisée en 64 canaux qui sont chacun 16 ~ um de large.
5. Répétez les étapes 7.1 7.3 pour toutes les images et la somme du nombre total de cellules pour chaque canal à travers toutes les images. Cela donne le nombre total de cellules détectées à chaque canal au cours de la durée de l'expérience.
6. Calculer le coefficient de partage chimiotactisme (PCC), qui représente la direction de la migration, comme suit: Chaque cellule située dans la haute concentration (à droite) et une faible concentration (à gauche) sur les côtés des cellules mortes est attribué un coefficient multiplicateur de 1 et -1 , respectivement. C'est une cellule qui migre d'un gradient est multipliée par 1 tandis que les cellules en descendant la pente sont multipliés par -1. Toutes les valeurs sont multipliés sont additionnés et normalisés pour le nombre total de cellules détectées. Par exemple, une valeur CPC de 0,40 indique que 40% de plus des bactéries totales déplacé sur le côté haute concentration que le côté faible concentration (ie, le chemoeffector un attractif que plus de bactéries ont été détectées le déplacement jusqu'à la pente).
7. Calculer le coefficient de migration chimiotactisme (CMC), qui pèse la migration des cellules par la distance parcourue, comme suit: Poids de la numération des cellules dans chaque canal par un facteur qui est proportionnelle à la distance que les cellules migrent. Une cellule qui se déplace vers le plus éloigné à forte concentration de position (canal 64) est donné un facteur de pondération de 1, tandis que celui qui se déplace à mi-chemin dans le côté plus forte concentration se voit attribuer un facteur de pondération de 0,5, et une cellule de passer à la plus éloignée faible concentration de position est pondéré par -1. Somme toute la numération des cellules pondérées et normaliser le nombre de cellules pour générer la CMC.

^3,4 résultats représentatifs:

Nous avons utilisé le dispositif microfluidique (figure 1A) décrit ici pour enquêter sur le chimiotactisme des E. coli dans des gradients d'attractifs (l'acide aspartique, autoinducteur-2) et des répulsifs (NiSO _4, l'indole) ^3,4. Le prototype de chimiotactisme souche ⁵ E. coli exprimant la GFP RP437 a été utilisé, avec la kanamycine tué E. coli TG1 cellules exprimant une protéine fluorescente rouge pour surveiller les effets des flux. Le gradient de concentration formé dans le dispositif μFlow est montré dans la figure 1B. L'entrée de la cellule a été plafonné, de sorte qu'il n'y avait pas de flux à travers elle et un gradient stable de 0 à 100 ng / mL de fluoresscein a été établi dans l'appareil. L'intensité d'un pixel à travers le dispositif a été utilisé pour déterminer le profil de concentration de fluorescéine. Les données montrent que les bactéries rencontrez un dégradé linéaire quand ils entrent dans la chambre de chimiotactisme. Figure 2A et B montre des images de fluorescence de E. coli RP437 migrer en réponse à des gradients de l'acide aspartique (0 100 M) et NiSO ₄ (0 225 uM). Les réponses observées à ces attractif et répulsif canoniques sont comme prévu. Figure 3A montre la répartition chiffrée des E. coli RP437 en l'absence d'un gradient de concentration (ie, la pente nulle de l'acide aspartique), tandis queFigures 3B et C montrent la distribution des gradients de l'acide aspartique et NiSO _4. La spécificité de ces réponses (ie, le biais de la migration) se présente comme une E. coli RP437 Δ tar souche (ie, la souche qui n'ont pas les chémorécepteurs de goudron qui est utilisé dans E. coli au sens acide aspartique et de nickel) ne démontre pas le biais de la migration dans la présence d'un gradient de concentration de l'acide aspartique ou NiSO _4. Les tendances évidentes dans les profils de distribution spatiale sont également compatibles avec le PCC et les valeurs calculées CMC. Les valeurs PCC pour la migration de E. coli dans le RP437 gradients de l'acide aspartique ou de sulfate ₄ sont 0,33 et -0,33, respectivement. Les valeurs correspondantes sont de CMC et de 0,13 -0,14, respectivement. En revanche, le PCC et MCC valeurs avec les E. coli RP437 Δ tar souche dans des gradients de l'acide aspartique ou NiSO ₄ sont négligeables. En outre, le PCC et le CMC dans un gradient nul de l'acide aspartique sont 0,03 et 0,02, respectivement, et indiquer l'absence de biais dans la migration en l'absence d'un gradient.

Figure 1. Schématiques périphériques et gradient de concentration.
Représentation schématique (A) du dispositif microfluidique chimiotactisme. Le dispositif se compose d'un module de gradient de mélange (20 x 100 x 18 750 um) et un module d'observation chimiotactisme (20 x 1050 x 11 500 um). Les largeurs des deux canaux de gradient entrer dans le dispositif sont de 500 um et la largeur de l'entrée de bactéries est de 50 um. L'encart montre un gradient de molécule de signalisation (gris) et les bactéries migrent en réponse à elle. Des bactéries vivantes sont dépeints comme des ovales solide, alors que les bactéries mortes sont représentés par des ovales ouverts. (B) Un gradient de concentration entre 0 et 100 ng / ml de fluorescéine a été générée dans l'appareil et imagées par microscopie à fluorescence. Images de fluorescence ont été acquises après 30 min et quantifiée par analyse d'image.

Figure 2. Chimiotactisme des E. coli RP437 dans le dispositif microfluidique.
E. coli RP437 a été exposé à un gradient de (A) 0-100 pM L-aspartate ou (B) 0 à 225 uM NiSO ₄ dans l'appareil et la migration des bactéries vivantes (vert) en direction de L-aspartate ou loin de nickel imagée à toutes les secondes de 2,5 pour 30 min. Bactéries mortes (en rouge) a servi de contrôle pour les effets d'écoulement dans le dispositif. Les images ont été quantifiés en utilisant une développée en interne l'analyse programme3. Les données présentées sont représentatives des pseudo-couleur des images à partir de trois expériences indépendantes.

Figure 3: Quantification des profils de migration d'un attractif et répulsif canoniques.
La distribution spatiale des RP437 dans le dispositif microfluidique en réponse à (A) uniformes 100 pM L-aspartate (ie, pas de gradient), (B) un gradient de 0 100 uM de l'aspartate, et (C) un gradient de 0 225 uM de NiSO ₄ . La distribution des cellules mortes est représentée par une ligne solide, la distribution de cellules RP437 est montré comme une ligne pointillée, et la distribution de cellules RP437 eda ⁺ tar Δ est montré comme une ligne pointillée. Les données présentées sont en moyenne de trois expériences indépendantes.

Discussion

Le coefficient de partage chimiotactisme (PCC) et le coefficient de migration chimiotactisme (CMC) peut être calculé comme décrit dans Mao et al ^5. Si une cellule est détectée sur le côté haute concentration, il est donné une valeur de 1, alors qu'une cellule détectée sur le côté faible concentration est donné une valeur de -1. Les valeurs sont additionnées et divisées par le nombre total de cellules pour générer le PCC. Le signe de la CPC (positive ou négative) donne la direction de la migration (vers ou à partir d'un signal). Bien que le PCC indique si les cellules répondent à un produit chimique comme attractif ou répulsif, elle ne quantifie pas l'ampleur de la chimiotaxie. Pour cela, nous calculons la CMC en divisant le profil de la distribution spatiale des bactéries sur la largeur de l'appareil en 64 sections (32 de chaque côté de l'entrée de la cellule), et en attribuant un facteur de pondération pour les cellules dans chaque section, basés sur la distance de migration. Les sections plus éloignée du centre (articles 1 et 64) sont multipliés par 1 (= 31.5/31.5) ou -1 car elles contiennent des cellules qui ont migré de la distance maximale. Les deux sections suivantes (2 et 63) sont multipliés par 0.968 (= 30.5/31.5) ou -0.968. Les deux dernières sections (soit 32 et 33 qui sont plus près de l'entrée cellulaire) sont multipliés par 0.015 + (= 0.5/31.5) ou -0.015. Les valeurs pondérées sont additionnées et normalisé au nombre total de cellules de générer la CMC. Un CMC de +1 indique que toutes les bactéries complètement déplacée jusqu'à la pente de la paroi de la chambre de flux. Dans le cas d'une légère réaction intéressante, le CMC serait toujours un effet positif, mais qui ont une valeur plus faible, alors que la valeur CPC serait encore une. Ainsi, le CMC discrimine cellules sensibles basés sur l'ampleur de la migration.

Certains paramètres doivent être soigneusement contrôlée tout en effectuant des expériences de chimiotaxie. La température à laquelle les bactéries sont cultivées est important. Pour E. coli, nous avons observé que la meilleure température de croissance est de 32 ° C et des températures supérieures à réduire la motilité. Pour certains récepteurs à être présentes dans les bactéries, il peut être nécessaire de pousser les bactéries en présence d'une induction de chemoeffector (c'est à dire, au premier les cellules de la chimiotaxie). Par exemple, lorsqu'il examine la réponse des bactéries aux maltose, les cellules sont cultivées avec 0,1% (p / v) de sucre. Lorsque la remise en suspension des bactéries après centrifugation, il est important que agitant doucement / laminage du tube est effectué et les cellules ne sont pas vortex. Une agitation vigoureuse peut cisailler les flagelles et de réduire la motilité des cellules testées. Les débits utilisés dans le dispositif devra être déterminé sur la base de la motilité de la bactérie testée. Débits plus lents peuvent être nécessaires pour les bactéries qui sont moins mobiles, et le débit optimal doit être déterminé de manière empirique.

Nous prévoyons que l'appareil μFlow peut être utilisé pour les recherches fondamentales sur le chimiotactisme des bactéries (par exemple, la concurrence entre chemoeffectors pour le même récepteur) ainsi que dans l'identification des bactéries dans les échantillons environnementaux qui répondent à certains produits chimiques comme attractifs ou répulsifs.