鋤鼻上皮の多電極アレイ録音

Summary

多電極アレイ（MEA）の録音は、神経細胞の大規模な集団の電気的活動を研究するための方法を提供する。同時に組織を刺激しながらここで、我々はマウス鋤鼻上皮からのレコードにMEAの準備の詳細を示す。

Abstract

神経回路を理解することの方法は同時に多数のニューロンから記録する必要があります。の

Protocol

パート1。電気的記録計

1. 我々は、窒化ケイ素で絶縁さ10μmの平坦な窒化チタン電極を有する平面多電極アレイを（ALAサイエンティフィックインスツルメンツ）を使用します。 60電極が30μmの中心間距離と5X6のグリッドで構成される二つのフィールドに配置されています。 （その他の構成も可能です。直径の記録面は10μmで電極が単一ニューロンの活動を分離するという点で大きな電極よりも優れています。）
2. 電気信号は、MEA 1060アンプ（ALAサイエンティフィックインスツルメンツ）を使用して（1000倍の増幅）増幅されています。信号は、データ集録カード（ナショナルインスツルメンツ）と、カスタムデータ集録ソフトウェア（1つにも商用ソフトウェアを購入できます）を使用して10 kHzで取得されています。
3. 組織はMEAの培養チューブのリングの内側にぴったり合うカスタムインサートに接続されているナイロンメッシュ（53ミクロン）、によってMEAを下に開催されます。

パート2。液体供給計装

1. 組織は、我々はリンゲル溶液（115 mM塩化ナトリウム、5mMの塩化カリウム、2mMの塩化カルシウム、2mMの塩化マグネシウム、25mMの重炭酸ナトリウム、10mMのHEPES、10 mMのD -（+を供給することにより保証する連続的な灌流を必要とし、 HPLCポンプから） - グルコース）。刺激はHPLCバルブに注射を行うとフロースルーとループとの間で切り替えることにより表示されます。 HPLCポンプとインジェクションのロボットのシリンジポンプの両方は、リンゲル液に付属しています。
2. リンゲル液は、実験全体を通して42℃温水槽（ISOTEMP 105）° Cに保持され、連続して95％O ₂ / 5％CO ₂でバブリングする。グルコースのないリンゲルの別のフラスコにシリンジポンプをバックアップ用に準備されています。リンゲル溶液を3mL /分の速度で307 HPLCポンプ（ギルソン）を使用して組織に配信されます。典型的な5〜6時間の実験では、各リンゲル溶液1Lで十分です。
3. 実験全体を通して、組織は継続的に37℃のリンゲル液で灌流される。ヒータープローブが直接組織上方に位置している。
4. 刺激はギルソン215液体ハンドラロボットアームを使って配信されます。刺激はゴムキャップ付きガラスバイアルに保存され、一定の流量と圧力が維持されている間ギルソンソフトウェアの制御下で、ロボットアームは、灌流ラインに刺激を提供しています。
5. HPLCバルブ（ループが従事/従事していない）の状態は、神経活動との同期を確実にするために付加的なチャネルとして、買収のコンピュータによって記録される電気の電圧で表されます。

第3部。 MEAと刺激の配信デバイスの準備

1. 解剖を実行する前に、室温で少なくとも5分間dH2OでBSAとMEAの井戸を埋める。
2. ウォームバブルリンガー溶液を用いてMEAをすすぎ、氷上にMEAを置きます。
3. プライム液体ハンドラとHPLCは、製造元の指示に従ってポンプ。

パート4。 VNOの解剖

1. 解剖を行う前に、氷の上で泡立てリンゲル液と場所で2 60x15ミリメートルのペトリ皿を埋める。また、氷の上でリンゲル溶液と場所と同じサイズの2 Sylgardコーティングされたシャーレを埋める。解剖時に使用するためのウォームバブリングリンゲルの追加の50mLのを冷やします。
2. マウスは頚椎脱臼に続くCO ₂窒息を経由して犠牲にされています。
3. 頭の後ろに、顎のラインと平行に走る、口の側面から二国間の切開を加えます。首の後ろに沿って2カットに参加して、マウスに接続されている下顎を残して、頭部の背の部分を削除してください。
4. 細かいハサミを使用して、組織や骨から組織を分離するために上顎骨の両側の間にカット。
5. 鼻腔を公開するために口蓋の組織を剥がし、第3位鉗子を使用する。
6. 小さなはさみや骨から鋤鼻カプセルを解放する間、および上位2前歯の両側にカットメスを、使用する。
7. ＃3鉗子を使用して、氷の上でペトリ皿の平らな骨と場所によって鋤鼻カプセルを拾う。浸漬を通ってステップは3分未満で実行する必要があります。
8. 反射光で照らされた、実体顕微鏡下で皿を置きます。 ＃3鉗子を使用して、一度VNOから骨嚢を取り除く。 、離れてVNOから骨剥離する尾方端と他方の把持VNOを傷つけないように配慮して骨のカプセルを安定させるために片手で行ってください。
9. 骨が除去されると、SylgardコーティングしたシャーレにVNOを転送する。他のVNOの残りの皿を使用してください。透過光に照明を切り替えます。
10. マイクロシザーまたは＃5ピンセットを使用して、VNOの端に沿って切断することにより血管からVNOを分離。この時点では、なります完全に血管から分離された神経のシートを持っている。
11. 内部（樹）面を上にVNOを置きます。 ＃3鉗子を使用して、組織の隅にSylgardにVNOを固定。クランプで開催されたテフロンコーティングされたかみそりの刃の小さな断片を用いて基底膜からの神経上皮ピール。浅い角度（<30 °皿の表面から）でブレードを保持することが最善の方法です。
12. ガラスピペットを用いて、皿からMEAへの神経上皮の一部を譲渡する。上樹側で電極のフィールドの上にVNOを置きます。ピペットと過​​剰リンゲル液を取り外します。場所にVNOを保持し、冷却したリンゲル液で格納する配列のウェルにメッシュティッシュホルダーを置きます。

第5部。録画

1. MEA 1060アンプと位置を直接組織上のヒータープローブでMEAを置きます。
2. 適切なヒータープローブの配置を確認するには、リンゲル溶液が2秒間50 mMリン酸カリウムを（等モルナトリウムの代わりに）を含むと刺激する。カリウム溶液への神経応答の待ち時間を最小限に抑えるために位置を調整。
3. 組織が順応できるように、記録前の1時間に45分間加熱したリンゲル液で組織を表面かん流する。
4. 電気信号は、カスタムレコーディングソフトウェアを使ってディスクに保存されています。

第6部。データ解析

1. オフラインデータ解析は、生の電極の録音を使用して行うことができます。例えば、我々は、特定のリガンドに反応して記録された細胞の発火率の変化を測定する。結果のデータセットが大きく、さまざまな質問に対処するために使用することができます。プログラミングや解析言語（C言語、MATLAB、R、Pythonの、または類似の）の熟知が必要です。

パート7。代表的な結果

この準備は、通常、データ（60の電極から記録の6時間）を大量にもたらして、6時間から記録するのに十分安定しています。

図1：配列の半分にわたって同時活動のスナップショットが表示されます。時間ウィンドウは、400ミリ秒に広がっています。してくださいここをクリックして図1の拡大バージョンを参照すること。

図2典型的な実験では、我々は10秒間、関心のある特定の化合物で刺激する。このトレースは、100倍希釈した雌マウスの尿中への応答の例です。してくださいここをクリックして図2の拡大バージョンを参照すること。

Discussion

多電極アレイの録音は、私たちの神経細胞の大集団の同時活動を監視する能力を許可する。これは特に、VNOの感覚系の特性をプロービングするための便利なツールです。主嗅覚系とは異なり、VNOは、液相中で刺激を検出します。さらに、VNOは異種の組織です。おそらく別の応答プロファイルとマウス¹の受容体の約300の異なる種類があります。 MEAの録音は、私たちは確実にニューロンとアイデンティティ電気生理学的応答の大規模かつ多様な人口に液体の刺激を提供できるようにロボットアームと組み合わせる。さらに、in vitroでの VNOの安定性は、刺激の複数の繰り返しのための時間を確保できます。

以前は、この手法は、尿中³に存在する個々のリガンドを同定するための信頼性の高いアッセイとしてとして²マウスの尿に反応してVSNの官能特性を調査するために使用されています。将来的には、この手法は非常にさらに配位子の発見に有用とVNOの官能特性を特徴づけるのかもしれない。