Avaliação bidimensional ensaios (2D) de cristalização para a formação de matrizes de proteína de membrana ordenado é uma tarefa altamente crítico e difícil em cristalografia de elétrons. Aqui, descrevemos a nossa abordagem na triagem para identificação de cristais e 2D de proteínas da membrana predominantemente de pequena faixa de 15 - 90 kDa.
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Artigo de método
Avaliar Trials bidimensional cristalização de proteínas da membrana Pequenas de Estudos Biologia Estrutural por Cristalografia Electron
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
Cristalografia eletrônica tem evoluído como um método que pode ser usado tanto em alternativa ou em combinação com tridimensional cristalização e cristalografia de raios X para estudar estrutura-função perguntas de proteínas da membrana, bem como proteínas solúveis. Triagem para duas dimensões (2D) cristais por microscopia eletrônica de transmissão (EM) é o passo fundamental na busca, otimização e seleção de amostras de alta resolução de coleta de dados por crio-EM. Aqui, descrevemos as etapas fundamentais na identificação de grandes e ordenada, bem como pequenos arrays 2D, que pode potencialmente fornecer informações críticas para a otimização das condições de cristalização.
Ao trabalhar com diferentes ampliações no EM, os dados sobre uma série de parâmetros críticos é obtido. Menor ampliação fornece dados valiosos sobre o tamanho e morfologia de membrana. Em ampliações maiores, as dimensões de cristal possível fim e 2D são determinados. Neste contexto, é descrito como câmeras CCD e online-Transformações de Fourier são usados em ampliações maiores para avaliar proteoliposomes para a ordem e tamanho.
Apesar de os cristais 2D de proteínas da membrana são mais comumente cultivada por reconstituição por diálise, a técnica de rastreio é igualmente aplicável para cristais produzidos com a ajuda de monocamadas, nativo cristais 2D, e ordenou matrizes de proteínas solúveis. Além disso, os métodos aqui descritos são aplicáveis à triagem para cristais de 2D ainda menor, bem como proteínas de membrana maior, onde as proteínas menores requerem a mesma quantidade de cuidado na identificação como nossos exemplos ea rede de proteínas maiores podem ser mais facilmente identificáveis em fases anteriores do exame.
Protocolo
1. Preparação grade de Ensaios Cristalização 2D
- Carbono revestido de 400 malha de cobre EM grades são preparados por mancha negativa. Acetato de uranila é freqüentemente usado e fornece uma mancha de longa duração em termos de armazenamento da solução por vários meses antes do uso, bem como aptidão para armazenamento de longo prazo das grades. Em contraste, outras manchas negativas, como formiato de uranila, proporcionando excelente coloração, precisam ser feitos recentemente 1. Para a preparação rápida de um grande número de redes a ser utilizado para triagem de ensaios de cristalização em 2D, uma versão modificada da coloração negativa é usado....
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Discussão
Avaliação adequada de amostras requer uma avaliação cuidadosa de um número suficiente de membranas. Por exemplo, amostras com tão baixo como 2% matrizes cristalinas de mais de 180 proteoliposomes imaged deu informações importantes para a otimização rápida de condições de cristalização 2D 7.
Quando a precipitação da proteína ocorre, uma grade pode ser abandonado de rastreio mais após a inspeção com pequeno aumento, embora a precipitação parcial ocasional de proteína ocorre. Mesmo m.......
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Agradecimentos
Agradecemos aos nossos colaboradores para fornecer amostras de proteínas valiosas, que contribuíram para algumas das nossas experiências e observações métodos relacionados. Günther Schmalzing gentilmente cedido a oportunidade de FR para participar deste projeto. Barbara Armbruster, Jacob Brink e Deryck Mills são agradecidos por sua ajuda em circulação e de entrada no equipamento. O financiamento foi fornecido pelo NIH conceder HL090630.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Grade de microscopia eletrônica de transmissão (TEM) de cobre 400-mesh revestida com filme de carbono | |||
| Pinça: comum e anti-capilar | Dumont #5 e Dumont N5AC ou similar | ||
| Micropipeta e ponteiras para pipeta | |||
| Papel filtro Whatman #4 | |||
| Acetato de uranila 1% | |||
| Amostra de diálise a ser analisada quanto à presença de cristais 2D | |||
| Tampão de diálise livre de glicerol/sacarose | Opcional | ||
| Microscópio eletrônico de transmissão JEOL-1400 (TEM) | TEM similar de 80 – 120 kV equipado com filamento de Lab6 ou tungstênio e câmeras de filme e/ou CCD (câmeras Gatan Orius SC1000 e/ou UltraScan1000 CCD e pacote de software Gatan Digital Micrograph ou câmeras Tietz (TVIPS)) |
Referências
- Johansen, B. V. Bright field electron microscopy of biological specimens V. A low dose pre-irradiation procedure reducing beam damage. Micron. 7, 145-156 (1976).
- Schmidt-Krey, I. Electron crysta....
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Reimpressões e permissões
