O electroolfactogram gravação (EOG) é uma maneira informativa de fácil condução e confiável de avaliação da função olfativa ao nível do epitélio olfativo. Este protocolo descreve uma configuração de gravação, de preparação dos tecidos mouse, coleta de dados e análise de dados básicos.
Animais dependem do olfato para muitos comportamentos críticos, tais como encontrar fontes de alimentos, evitar predadores, ea identificação de membros da mesma espécie para acasalamento e outras interações sociais. O electroolfactogram gravação (EOG) é um método informativo, fácil de conduzir, e de confiança para a função teste olfativo no nível do epitélio olfativo. Desde a descrição de 1956 do EOG por Ottoson em rãs 1, a gravação EOG tem sido aplicado em muitos vertebrados, incluindo salamandras, coelhos, ratos, camundongos e humanos (revisado por Scott e Scott-Johnson, 2002, ref. 2). Os recentes avanços na modificação genética em camundongos reacenderam o interesse pela gravação do EOG para a caracterização fisiológica da função olfativa em knock-out e knock-em camundongos. EOG gravações têm sido aplicados com sucesso para demonstrar o papel central das componentes de sinal olfativo de transdução de 3-8, e mais recentemente para caracterizar a contribuição de certos mecanismos de regulação de respostas OSN 12/09.
Detecção de odores ocorre na superfície do epitélio olfativo sobre os cílios de ORS, onde uma cascata de transdução de sinal leva à abertura de canais iônicos, gerando uma corrente que flui para os cílios e despolariza a membrana 13. O EOG é o potencial negativo registrado extracelularmente na superfície do epitélio olfativo com a estimulação odorant, resultante de um somatório das mudanças potenciais causados pela individuais ORS resposta no campo de gravação 2. Comparação da amplitude e da cinética do EOG, assim, fornecer informações valiosas sobre como modificação genética e outras manipulações experimentais influenciam a sinalização molecular subjacente a resposta à OSN odor.
Aqui nós descrevemos uma gravação EOG ar-fase em uma preparação de cornetos rato olfativo. Resumidamente, depois de sacrificar o rato, o cornetos olfativos são expostos por bisecting a cabeça ao longo da linha média e remoção do septo. A preparação concha é então colocada na configuração de gravação, e um eletrodo de gravação é colocado na superfície do epitélio olfativo em uma das conchas nasais medial. Um eletrodo de referência é eletricamente conectada ao tecido através de uma solução tampão. Um fluxo contínuo de ar umidificado é soprado sobre a superfície do epitélio para mantê-lo úmido. O vapor de soluções odorant é soprado para a corrente de ar umidificado para estimular o epitélio. Respostas são gravadas e digitalizadas para posterior análise.
Parte 1. A configuração de gravação EOG
O aparelho de gravação consiste de um eletrodo de registro, eletrodo de referência, tubo de ar, estágio da amostra, e microscópio de dissecação, tudo ancorado em uma mesa de ar dentro de uma gaiola de Faraday. Micromanipuladores são usadas para a colocação dos eletrodos e do tubo de entrada de ar. A corrente de ar contínua é borbulhar na água destilada para adicionar umidade antes de passar através do tubo de vazão de ar e sobre a amostra. A placa de cultura 60 milímetros cheio de Sylgard a uma profundidade de 6-8 mm é usada como uma superfície de montagem para a amostra. Um bem e um canal são esvaziadas do Sylgard no prato de montagem para fornecer um meio para conectar eletricamente o eletrodo de referência com o modelo modificado através de solução de Ringer.
O eletrodo de registro eo eletrodo de referência são conectados a um amplificador. Sinais do amplificador são enviados para um digitalizador e, em seguida, a um computador. Software, tais como Axograph ou pClamp pode ser usado para controlar o protocolo de estimulação, para gravar o sinal, e para posterior análise das respostas. Um osciloscópio conectado após o amplificador pode ser conveniente para monitoramento em tempo real do potencial elétrico ao colocar o eletrodo de gravação e durante as gravações EOG.
Entrega de estímulos olfativos é controlado por um Picospritzer, que é conectado ao mesmo computador usado para a aquisição de sinal. A pressão do ar no Picospritzer está definido para 10 psi. Um único tanque de ar e regulador pode ser usado para suprimento de ar para o ar tanto tabela eo Picospritzer. Um segundo tanque de ar e regulador é usado para fornecer ar para a corrente de ar umidificado, pois isso requer uma pressão mais baixa e uma grande quantidade de fluxo de ar. Pouco antes de entregar um estímulo odorante, a saída Picospritzer está conectado a uma garrafa de odores. A garrafa odorant é então ligado ao tubo de ar.
Parte 2: Preparando-se eletrodos
O eletrodo de gravação é um fio de prata chlorided em um copo puxado capilar preenchido com solução de Ringer modificado (135 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM CaCl 2, 1,5 mM MgCl 2, 10 mM HEPES, pH 7,4, esterilizado por filtração). O eletrodo de referência é um fio de prata chlorided.
Parte 3: Preparar soluções odorant
O acetato de amila odores e heptaldehyde evocam respostas grandes e, assim, são escolhas boas como estimulantes EOG.
Parte 4: Gravação dos dados e análise de EOG
Resultados representante
Figura 1. Parâmetros para EOG análise. Vários parâmetros do EOG são particularmente úteis para a comparação de respostas entre os ratos, incluindo a amplitude da resposta, a latência (o tempo entre quando o estímulo é administrado ea resposta começa), aumento do tempo (o tempo entre o início da resposta eo pico), tempo de pico (o tempo desde o início do estímulo até o pico da resposta), e constante de tempo de terminação (τ, determinado pelo ajuste a fase de decadência da resposta a uma única equação exponencial ). Para a comparação dos parâmetros cinéticos, tais como latência, tempo de subida, e constante de tempo de terminação, é aconselhável para normalizar a amplitude do pico das respostas antes da análise.
Figura 2. Representante EOG sinais em diferentes protocolos de estimulação. (A) Exemplos de EOGs de um camundongo em resposta à estimulação com concentrações crescentes de acetato de amila. A linha preta na parte superior do painel indica o momento ea duração do estímulo odorante. As concentrações na legenda são as concentrações da solução líquida. (B) A relação dose-resposta em média de cinco camundongos. Barras de erro são os intervalos de confiança de 95%. Um declínio na amplitude de pico é freqüentemente observado em concentrações odor muito alto. (C) Um exemplo de um EOG em resposta a um estímulo emparelhado pulso. Um único pulso curto de odorant provoca adaptação com duração de vários segundos. (D) Um exemplo de um EOG em resposta a uma de 10 seg sustentada estímulo odorante. O EOG dessensibilização mostra durante a apresentação odorant contínua.
Com a configuração descrita neste protocolo, os estímulos olfativos na superfície do epitélio olfativo será consistente entre preparações de tecido, permitindo a comparação entre o tipo selvagem e ratos mutantes, embora a concentração de odores e dinâmica exata é desconhecida. Vários fatores, especialmente a localização de gravação ea taxa de fluxo de ar umidificado, causam variações na EOG. Cuidados devem ser tomados para gravar a partir de posições semelhantes sobre o corneto mesmo para minimizar a variação. Isto pode ser facilmente alcançado de forma consistente a gravação do mesmo lado da cabeça e manter a pegada do microscópio, tubo de odor, e micromanipuladores sobre a mesa de ar inalterada entre amostras de tecido. Além disso, amostras de tecido deve ser colocado imediatamente no fluxo de ar umidificado após a dissecção para evitar a secagem excessiva do tecido.
EOG gravações em ratos também podem ser realizadas com um aparelho de perfusão de líquido no mouse preparado cornetos 7, 14, 15, ou deixando a cabeça intacta e inserindo o eletrodo em um pequeno buraco perfurado acima dos cornetos 16, 17. Cada variação de gravação EOG tem suas próprias forças: ar-fase gravações em preparações de tecido, conforme descrito neste protocolo requer uma quantidade mínima de instalação e são mais fáceis de conduta; gravações usando um aparelho de perfusão de líquidos facilitar o uso de reagentes farmacológicas, embora o natureza hidrofóbica de odores muitas complica entrega odor, por último, as gravações em que o chefe é deixada intacta pode ser usado em 'artificial sniff' experimentos, embora a colocação do eletrodo é mais difícil do que quando os cornetos estão totalmente expostos.
The authors have nothing to disclose.
Air delivery tube | equipment | Custom Made | The barrel of a 1-mL syringe with a T-fitting can be used as a substitute | |
Air table | equipment | Newport Corp. | LW3030B-OPT | |
Amplifier | equipment | Warner Instruments | DP-301 | |
Computer and Data Acquisition Software | equipment | Axograph 4.9.2 on Apple Macintosh | Updated versions of Axograph for Mac OS X and Windows are available from http://axographx.com/. | |
Butane torch | equipment | A crème brûlèe torch works well | ||
Digitizer | equipment | Axon Instruments | Digidata 1322A | |
Dissecting Scope | equipment | Scienscope | SSZ | |
Electrode holder | equipment | Harvard Apparatus | 64-1021 | |
Magnetic Holding Devices (12 mm) | equipment | World Precision Instruments, Inc. | M10 | |
Micromanipulators | equipment | World Precision Instruments, Inc. | M3301R M3301L | |
Micropipette Puller | equipment | Sutter Instrument Co. | P2000 | |
Oscilloscope | equipment | Tektronix, Inc. | 5110 | |
Picospritzer III | equipment | Parker Hannifin Corporation | ||
Silicone tubing | equipment | Nalge Nunc international | ||
Specimen stage | equipment | Custom Made | Any small solid object can be used to elevate the mounting dish. Immobilize the dish with modeling clay. | |
18 gage needles | material | BD Biosciences | 305195 | |
2 oz. glass bottles | material | VWR international | 16152-201 | |
Glass capillaries | material | World Precision Instruments, Inc. | TW150F-6 | |
Silicone stoppers size 16D | material | Chemware | D1069809 | |
Silver wire | material | World Precision Instruments, Inc. | AGW1010 | |
SylGuard 184 | material | Dow Corning | SYLG184 | From World Precision Instruments |
Agarose | reagent | Invitrogen | 15510-027 | |
Amyl acetate | reagent | Aldrich | W504009 | |
Calcium chloride (CaCl<sub>2</sub>) | reagent | Sigma-Aldrich | C-1016 | |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | reagent | Sigma-Aldrich | D5879 | |
HEPES | reagent | Fisher Scientific | BP310 | |
Heptaldehyde | reagent | Aldrich | H2120 | |
Magnesium chloride hexahydrate (MgCl<sub>2</sub>+6H<sub>2</sub>O) | reagent | Sigma-Aldrich | M9272 | |
Sodium chloride (NaCl) | reagent | JT Baker | 3624-05 | |
flowmeter | equipment | Gilmont Instruments | GF-2260 |