Expressão de proteínas recombinantes em levedura metilotróficas Pichia pastoris</em

Resumo

O protocolo descreve a expressão da proteína utilizando a levedura metilotróficas Pichia pastoris. A preparação de células de levedura electrocompetent, a transformação do vetor com o gene de interesse em P. pastoris E purificação do DNA de levedura também são realizados. Ocidental blot e purificação de proteínas construir os últimos passos neste protocolo expressão da proteína.

Resumo

Expressão da proteína na Pichia pastoris eucarióticas anfitrião microbiana oferece a possibilidade de gerar grandes quantidades de proteína recombinante em um sistema de expressão rápida e fácil de usar.

Como um microorganismo unicelular P. pastoris é fácil de manipular e cresce rapidamente em meios baratos em altas densidades celulares. Ser um eucariota, P. pastoris é capaz de executar muitas das modificações pós-translacionais executada por células eucarióticas e as proteínas recombinantes obtidas sofrer dobramento de proteínas, processamento proteolítico, formação da ligação dissulfeto e glicosilação [1].

Como um metilotróficas levedura P. pastoris é capaz de metabolizar metanol como única fonte de carbono. O promotor forte para oxidase de álcool, AOX1, é estreitamente regulada e induzidos pelo metanol e é usado para a expressão do gene de interesse. Assim, a expressão da proteína estranha pode ser induzida pela adição de metanol ao meio de crescimento [2, 3].

Outra vantagem importante é a secreção de proteína recombinante para o meio de crescimento, usando uma seqüência de sinais como alvo a proteína estranha à via de excreção de P. pastoris. Com apenas baixos níveis de proteína endógena secretada à mídia pela levedura em si e não proteínas adicionadas aos meios de comunicação, uma proteína heteróloga constrói a maioria das proteínas totais no médio e facilita seguintes etapas de purificação de proteínas [3, 4].

O vetor usado aqui (pPICZαA) contém o promotor AOX1 para bem regulamentada, a expressão de metanol induzida do gene de interesse; o sinal de secreção de α-fator para a secreção da proteína recombinante, um gene de resistência Zeocin para a seleção em ambos os E. coli e Pichia e um peptídeo C-terminal contendo o epítopo c-myc e um polyhistidine tag (6xHis) para a detecção e purificação de proteína recombinante. Mostramos também a análise de western blot a proteína recombinante usando o anticorpo anti-myc-HRP específica reconhecendo o epítopo c-myc no vetor pai.

Protocolo

Expressão de proteínas recombinantes em levedura Pichia pastoris metilotróficas

Antes de iniciar este protocolo você deve ter seu gene de interesse clonado no quadro em um P. vector pastoris pai e tê-lo seqüenciado para verificar a correta inserção do gene de interesse no vector.

Etapa I: Geração de células de levedura electrocompetent, linearização da construção e transformação em P. pastoris

Para esta etapa, você precisará ter as seguintes mídias e as placas na mão:

• Placas YPDS
• 600 mL meio YPD
• água gelada estéril
• 1 M sorbitol
• Amicon Ultra-4 Dispositivo Centrífuga Filtro
• Microcontrolador YM-30 Unidade Centrífuga Filtro
• 0,2 centímetros eletroporação cuvete
• 15 mL tubo de vidro estéril
• estéreis de vidro Pasteur Pipeta
• Placas contendo YPDS Zeocin

Parte 1: Preparação das células de levedura electrocompetent

1. Quatro dias antes da raia transformação pretendida fora P. pastoris células em um prato YPDS sem Zeocin e deixá-los crescer a 30 ° C por 1-2 dias ou até formar colónias único.
2. Dois dias antes da transformação destina crescer 5 ml de seu P. pastoris cepa em meio YPD em um tubo Falcon 50 ml a 30 ° C durante a noite. Colocar o tubo Falcon em um frasco para corrigi-lo no shaker.
3. O dia antes da transformação inocular 500 mL de meio YPD fresco em um frasco de 2 litros com 0,25 mL da cultura durante a noite e deixar crescer novamente durante a noite em um agitador a 30 ° C para um OD ₆₀₀ = 1,3-1,5.
   Nota: diluir a amostra antes da medição no espectrofotômetro para que você obtenha um resultado preciso.
4. O dia da transformação ter água gelada estéril e sorbitol 1 M na mão. Centrifugar as células a 1500 xg por 5 minutos a 4 ° C. Ressuspender o sedimento com 500 mL de água gelada, estéril.
5. Centrifugar as células novamente como no passo 4. Ressuspender o sedimento com 250 mL de água gelada, estéril.
6. Centrifugar as células novamente como no passo 4. Ressuspender o sedimento em 20 mL de gelada 1 M sorbitol.
7. Centrifugar as células novamente como no passo 4. Ressuspender o sedimento em 1 mL de gelada M 1 sorbitol a um volume final de aproximadamente 1,5 mL. Células loja no gelo ou a 4 ° C até à sua utilização.
   Nota: nós nos preparamos mais células electrocompetent do que o necessário e guarde-os em alíquotas de 80 mL em tubos de microcentrífuga a -80 ° C. Nós usamos as células armazenadas por um período máximo de um mês.

Parte 2: Linearização e concentração da construção pPICZαA

Para a transformação linearizar o vetor contendo o gene de interesse por restrição digerir. Usamos o PmeI enzima. Sítios de restrição são possíveis outros. Você tem que se certificar de que sua inserção não contém o sítio de restrição que deseja usar para linearizar seu vetor. Para transformação em P. pastoris você vai precisar 50-20 mg de DNA linearizado em água mL 10/05 estéril.

Também linearizar, concentrado e transferir o vetor simples (sem inserção) em P. pastoris. O vetor de pai sem que a inserção é um controle para a expressão intracelular de fundo e permite que você para interpretar os resultados da sua expressão.

1. Descongelar todos os reagentes no gelo, combine os seguintes reagentes e brevemente o tubo de centrífuga para obter todo o líquido até o fundo, toque no tubo e girar novamente:
   • x mL de água estéril
   • 5.0 4 mL NEBuffer 10X
   • 0,5 mL BSA 100X
   • até 2 mg DNA do vetor (~ 100 ng / mL)
   • 2,0 mL Pme mistura de enzimas que
   → volume de reação 50 mL totais
   Nota: para obter DNA suficiente vetor linearizado preparar a mistura acima de 3 ou 4 vezes em tubos separados e combinar as soluções quando concentrar o DNA digerido via Amicon dispositivo ultracentrífugo.
2. Incubar a 37 ° C por 3 horas e calor inativar a enzima mistura a 65 ° C por 20 minutos.
3. No tempo médio de pré-enxágüe uma Amicon Ultra-4 Dispositivo Centrífuga de filtro com 1 mL de água Milli-Q, girar o tubo a 4000 xg por 6-8 minutos e descartar a fluir.
   Nota: não permitir que a membrana a secar, uma vez molhado. Se você não estiver usando o dispositivo após a pré-lavagem, deixar água na membrana até que o dispositivo é utilizado.
4. Transferir a solução inativado pelo calor da etapa 2 para a pré-lavado Unidade Filtro Amicon centrífuga, girar o tubo a 4000 xg por 6-8 minutos e descartar a fluir.
   Nota: se você tiver preparado mais de um mix de linearização, combine todas as soluções em uma Unidade de Filtro Amicon centrífuga.
5. Centrifugar até que a quantidade de solução no filtro Amicon é reduzida a cerca de 100 ~ 150 & mu; l. Adicionar outro 1,5 mL de água estéril ao tubo vazio de cima e transferir a solução para o tubo Amicon e repita os passos de centrifugação. Lavar uma segunda vez com 1,5 mL de água estéril e descartar fluir através de novo. Reduzir o volume final para ~ 150 mL. Os passos de lavagem remover o sal restante do buffer para prevenir arqueamento quando pulsar das células.
   Nota: usamos um rotor de caçamba móvel para a etapa de centrifugação, basta colocar o capped Amicon unidade centrífuga filtro em um tubo Falcon 50 mL para mantê-lo no lugar durante a centrifugação. Dispositivos Amicon filtro reter 50 ml de solução no filtro, mesmo após a centrifugação prolongada.
6. Para uma maior concentração da preparação de DNA transferir a solução DNA restante do dispositivo Amicon filtro a um microcontrolador pré-lavado YM-30 Unidade Centrífuga filtro e lavar o tubo Amicon com um adicional de 50 mL de água estéril para recuperar todo o DNA. Centrifugar o microcontrolador Unidade Centrífuga de filtro em uma microcentrífuga a 10.000 xg até que o filtro ainda é ligeiramente cobertos com o líquido. Só girar para um curto período de tempo e verificar a cada minuto, se apenas uma pequena quantidade de líquido que resta no filtro. Para recuperar a sua solução de DNA, coloque a cabeça para baixo do filtro em um tubo de microcentrífuga novo e giram em uma etapa de centrifugação segundo a 1000 xg por 3 minutos. O volume final não deve exceder 10-15 mL no total, caso contrário o seu DNA pode ser muito diluída para a etapa de transformação.
   Nota: não girar o dispositivo de filtro muito tempo e deixá-lo não secar completamente para evitar a perda de amostra potencial. Se a sua membrana é seca, adicione água 10-15 mL estéril para a membrana, agitar suavemente durante 30 segundos e recuperar seu DNA como descrito acima.

Parte 3: Transformação em P. pastoris por eletroporação

1. O linearizado e concentrado contendo DNA pPICZαA sua inserção agora está pronto para transformação em P. electrocompetent células pastoris (consulte a etapa I, parte 2). Cerca de 15 minutos antes da transformação preparar os seguintes reagentes e dispositivos: encher um tubo de microcentrífuga com 1 mL de 1 M sorbitol e colocá-lo no gelo, coloque uma cubeta de eletroporação 0,2 cm de gelo; um rótulo estéril 15 mL tubo de vidro e ter um estéril Pasteur de vidro pipeta na mão.
2. Transferência de 80 mL das células a partir da etapa I, parte 2.7 para uma gelada cubeta de eletroporação 0,2 centímetros. Adicione o concentrado de solução linearizada pPICZαA DNA a partir da etapa I, parte 3.6 e mix movendo a ponta da pipeta de lado a lado na cubeta de eletroporação.
   Nota: ao adicionar o DNA só empurrar pipeta para a primeira parada. Após a mistura do DNA com as células empurrar pipeta para a segunda parada e lentamente remover da cuvete.
3. Incubar a cubeta com as células no gelo por 5 minutos.
4. Limpe a parte externa da cubeta com um lenço de papel e pulso as células de acordo com os parâmetros de levedura (Saccharomyces cerevisiae), como sugerido pelo fabricante do aparelho eletroporação específico a ser utilizado.
   Nota: usamos uma GenePulser Bio-Rad com as seguintes condições:
   • Tensão de carregamento (V): 1500;
   • Capacitância (mF): 25;
   • Resistência (Ω): 200.
   Usando uma cubeta de eletroporação 0,2 centímetros, o protocolo gera um comprimento de pulso de ~ 10 ms com uma força de campo de ~ 7500 V / cm.
5. Imediatamente adicione 1 mL de gelada 1 M sorbitol a cuvete. Transferir o conteúdo cuvete a um tubo de 15 mL estéreis usando o vidro estéril Pasteur pipeta.
6. Deixe o tubo de incubar a 30 ° C sem agitação por 1,5 horas.
7. Adicionar 5-7 gotas de vidro esterilizado em quatro placas rotulados YPDS contendo 100 mcg / mL Zeocin. Spread 250 mL da mistura de eletroporação do tubo de vidro de 15 mL em cada placa. Agite a placa horizontalmente para espalhar uniformemente as células. Deixe a placa secar durante 15 minutos e remova as contas do agar invertendo a placa.
   Nota: usamos 100 mcg / mL Zeocin selecionar para transformantes quando se utiliza a cepa Pichia GS115. As condições de seleção podem variar se você estiver usando outra cepa Pichia.
8. Incubar as placas de cabeça para baixo por 2 a 3 dias a 30 ° C até formar colônias. Enrole as placas em um plástico preto para impedir a degradação do Zeocin sensível à luz. Menor quantidade de antibióticos nas placas podem resultar em falsos clones positivos.
9. Depois de colônias formaram, pegar 12 colônias e purificá-los por estrias a clones de placas novas YPDS contendo 100 mcg / mL de Zeocin.

Etapa II: a expressão da proteína em Pichia pastoris

Para esta etapa, você precisará ter os seguintes meios de comunicação, placas e reagentes à mão:

• Médio BMGY
• glicerol, esterilizados
• Médio BMMY
• metanol, esterilizados
• Levedura Epicentro kit de purificação de DNA

Vocêtambém precisa de frascos seguintes:

• Balão de 250 mL, autoclavados
• 1 frasco L perplexo, autoclavado
• 200 copo mL, autoclavados

Parte 1: expressão da proteína em Pichia pastoris

Todos os passos seguintes também são realizados para o controle do vetor transformado (sem inserção).

1. Escolha uma única colônia das colônias Pichia purificada a partir da etapa I, parte 3,9 e inocular em 25 BMGY mL em um frasco estéril mL 250. Crescer a 30 ° C em uma incubadora de agitação (250-300 rpm) até que a cultura atinge uma OD ₆₀₀ = 06/02 (cerca de 16-18 horas).
   Nota: diluir a amostra antes da medição no espectrofotômetro para que você obtenha um resultado preciso. As células serão no log fase de crescimento.
2. Quando as células atingiram o OD apropriados ₆₀₀ prepare um estoque de glicerol. Transferência de 800 mL da cultura de células 25 mL para um frasco de 2 mL Corning criogénicos e adicionar 200 mL de glicerol esterilizado. Congelar o estoque de glicerol e armazenar a -80 ° C.
3. Para a purificação de DNA de levedura, transferir 1,5 mL da cultura de células 25 mL para um tubo de microcentrífuga. Colher as células por centrifugação a 1300 xg por 1 minuto à temperatura ambiente. Estas células são usadas para analisar integrantes Pichia de verificar se o gene de interesse foi integrado no genoma Pichia (consulte a etapa II, part2). Armazenar o pellet celular a 4 ° C até análise posterior.
4. Transferir o resto da cultura de 25 mL para um tubo Falcon 50 mL e colher as células por centrifugação a 3000 xg por 5 minutos em temperatura ambiente. Decantar o sobrenadante e colocar os tubos de cabeça para baixo em um tecido para remover qualquer mídia residual. Para lavar o pellet celular ressuspender em 20 mL BMMY para remover qualquer meio BMGY restantes, como o glicerol do meio BMGY pode inibir a expressão mais tarde. Centrifugar novamente a 3.000 xg por 5 minutos em temperatura ambiente e decantar o sobrenadante.
5. Ressuspender pellet celular para um OD ₆₀₀ de 1,0 em média BMMY de induzir a expressão (cerca de 100-200 mL) e transferir a cultura em um frasco de 1 litro perplexo. Cubra o recipiente com um copo de 200 mL e voltar a incubadora para continuar o crescimento a 30 ° C.
   Nota: é importante que a temperatura não deve ultrapassar 30 ° C. Se a temperatura oscila de sua incubadora, ajustar a temperatura a 28 ° C. Aeração adequada também é um parâmetro importante para a expressão eficiente durante a indução da metanol (quando induzindo a expressão, nunca ultrapassar um volume de cultura> 10-30% do seu volume de frasco total). É altamente recomendável o uso de frascos perplexo, pois introduzir mais oxigênio no meio de cultura.
6. Adicionar esterilizados metanol puro para uma concentração final de metanol de 0,5% a cada 24 horas para manter a indução.
7. Em determinados momentos após o início da expressão mL de transferência 1 da cultura para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Centrifugar a 1300 xg por 2,5 minutos em temperatura ambiente. Transferir o sobrenadante para um tubo de microcentrífuga separado 1,5 ml. Armazenar os pellets sobrenadante e células a -80 ° C até análise posterior. As amostras de diferentes momentos serão analisados ​​para estabelecer o período de tempo ideal para a expressão da proteína após a indução.
   Nota: nós escolhemos 6h, 12h, 24h, 36h e 48h como os pontos de tempo para a colheita das amostras. Um maior crescimento até 4 dias é possível. Os pontos de tempo ideal varia entre diferentes proteínas expressas.
8. Analisar os sobrenadantes e pelotas da pilha para a expressão da proteína por Coomassie manchada de SDS-PAGE e Western blot (não descritos neste protocolo).

Parte 2: Purificação do fermento DNA e análise de PCR dos integrantes Pichia

Todos os reagentes necessários para a etapa de purificação do DNA de levedura Pichia da cultura em BMGY estão incluídos no MasterPure Kit de Purificação de DNA de levedura Epicentro.
Nota: esta análise é adicional e é realizada para determinar se o gene de interesse foi integrado no genoma Pichia. O pellet celular a partir de uma amostra de 1,5 mL retirados da cultura em BMGY (consulte a etapa II, parte 1.3) é usada.

Siga as instruções do fermento MasterPure Epicentre manual de Purificação de DNA e executar um PCR com o DNA de levedura com primers específicos para a inserção. Analisar 3 mL de seu produto de PCR em gel de agarose contendo 1 mL de brometo de etídio. Incluir um marcador 1 Kb de tamanho ⁺ em um poço para interpretar o tamanho de sua inserção e visualizar o DNA usando uma estação de documentação gel.

A proteína recombinante podem ser analisados ​​por western blot. Purificação de proteínas pode ser realizada por purificação Sua tag-em-metal cobrado resina (não descritos neste protocolo).

Apêndice, lista de receitas

Etapa I:

1. Meio YPD:
   Para preparar 600 mLdo meio YPD (Yeast Extract peptonada Médio Dextrose) dissolver 5 g de extrato de levedura e 12 g de peptona em 540 mL de água. Autoclave por 20 minutos no ciclo líquido.
   Nesse meio tempo preparar 70 mL de dextrose 20% e filtrar-esterilizar antes do uso.
   Deixe a solução autoclavada legal ~ 60 ° C e adicionar 60 mL de filtro esterilizado dextrose 20%.
2. YPDS (+ Zeocin) placas:
   Para preparar 500 mL de YPDS + Zeocin ágar (extrato de levedura peptonada Médio Dextrose com Sorbitol) dissolver 5 g de extrato de levedura, 91,1 g de sorbitol e 10 g de peptona em 450 mL de água. Adicionar 10 g de agar e uma barra de agitação magnética e autoclave por 20 minutos no ciclo líquido.
   Nesse meio tempo preparar 60 mL de dextrose 20% e filtrar-esterilizar antes do uso.
   Deixe a solução autoclavada legal ~ 60 ° C, adicionar 50 mL de filtro esterilizado dextrose 20%.
   Pour alguns pratos antes de adicionar o antibiótico para placas YPDS sem Zeocin. Em seguida, adicione 500 mL de uma Zeocin 100 mg / ml de solução concentrada para obter uma concentração final de 100 Zeocin mcg / ml no agar. Vamos mexer em uma placa magnética, ao adicionar o antibiótico e deixe agitar durante cerca de um adicional de 2 minutos para misturar igualmente.
   Despeje mídia em placas de Petri e cubra com plástico preto. Deixe placas secas no banco durante a noite. Loja placas YPD contendo Zeocin a 4 ° C. A vida útil é de 1-2 semanas.
   Nota: a cobertura com o plástico é necessário porque Zeocin é sensível à luz.

Etapa II:

1. BMGY (Buffered Médio Glicerol complexo) e BMMY (Buffered Metanol complexo Médio):
   Dissolver 8 g para cada meio de extrato de levedura e 16 g de peptona em 560 mL de água. Autoclave por 20 minutos no ciclo líquido.
   Nesse meio tempo preparar as seguintes soluções:
   • 1 M tampão fosfato de potássio, pH 6,0:
   Combine 24 mL de 1M K ₂ HPO ₄ e 156 mL de 1M K ₂ HPO ₄ e confirmar que o pH = 6,0 (se o pH precisa ser ajustado, use ácido fosfórico ou KOH). Filtro de esterilizar e armazenar à temperatura ambiente. O prazo de validade desta solução é superior a um ano.
   • YNB 10X (13,4% Base de Dados de nitrogênio fermento com sulfato de amônio, sem aminoácidos):
   Dissolver 26,8 g de base nitrogenada de levedura (YNB) com sulfato de amônio e sem aminoácidos em 200 mL de água e filtro de esterilizar. Aquecer a solução para dissolver YNB completamente em água. Armazenar a 4 ° C. O prazo de validade desta solução é aproximadamente um ano. Nota: Como alternativa, use 3,4 g de YNB sem sulfato de amônio e sem aminoácidos e adicionar 10 g de sulfato de amônio.
   • 500X B (0,02% Biotina):
   Dissolver 10 mg de biotina em 50 mL de água e filtro de esterilizar. Armazenar a 4 ° C. O prazo de validade desta solução é aproximadamente um ano.
   • M 10X (5% de metanol):
   Misturar 5 ml de metanol com 95 mL de água. Filtro de esterilizar e armazenar a 4 ° C. O prazo de validade desta solução é de aproximadamente dois meses.
   • GY 10X (10% de glicerol):
   Misturar 10 mL de glicerol com 90 mL de água. Filtro de esterilizar. Conservar à temperatura ambiente. O prazo de validade desta solução é superior a um ano.
   Deixe a solução autoclavada arrefecer à temperatura ambiente, em seguida, adicione o seguinte e misture bem:
   • 80 mL 1 M tampão fosfato de potássio, pH 6,0;
   • 80 mL YNB 10X
   • 0,16 mL 500X B
   • 80 mL GY 10X
   Para a preparação de BMMY, adicionar 80 mL 10X M ao invés de glicerol.
   Loja de mídia a 4 ° C. O prazo de validade desta solução é de aproximadamente dois meses.

Resultados representante

Figura 1. Esta imagem mostra quatro western blot proteínas expressas (rotulados como 1605, 0537, 1228 e 1682) após 24 horas de expressão. O anticorpo usado para immunoblotting foi um anticorpo c-myc-HRP. A segunda faixa (rotulado N) é um controle negativo e estava carregado com sobrenadante de células que não expressam uma proteína recombinante, porque eles foram transformados com o pai (liso) vector.

Discussão

Expressão da proteína usando a levedura Pichia pastoris metilotróficas como um sistema host é descrita neste protocolo. A proteína pode ser secretado para o meio, dependendo do vector de clonagem usado. A secreção da proteína recombinante faz a purificação subseqüente mais fácil. No entanto, as condições mostradas podem ter que ser otimizado para a expressão de proteínas diferentes e mudanças nas condições e tempos de expressão pode resultar em níveis de proteínas. O vetor utilizado neste protocolo tem a caract...