Fertilização de Oócitos Xenopus Utilizando o método de transferência do host

Resumo

Procedimento para fertilizar Oócitos Xenopus Pelo método de transferência de host.

Resumo

Estudar a contribuição de moléculas herdada da mãe para o desenvolvimento inicial dos vertebrados é frequentemente prejudicada pelo tempo e despesa necessária para gerar animais mutantes efeito materno. Além disso, muitas das técnicas para superexpressão ou inibir a função do gene em organismos como Xenopus e zebrafish não suficientemente alvo crítico materna vias de sinalização, tais como sinalização Wnt. Em Xenopus, manipulando a função do gene em oócitos cultivados e, posteriormente, fecundá-los pode amenizar esses problemas até certo ponto. Ovócitos são manualmente defolliculated de tecido de ovário doador, injetado ou tratados de cultura como desejado, e então estimulados com progesterona para induzir a maturação. Em seguida, os oócitos são introduzidos na cavidade do corpo de um sapo anfitrião ovulando feminino, quando então eles serão translocados através do oviduto do hospedeiro e adquirir modificações e casacos de geléia necessário para a fertilização. Os embriões resultantes podem então ser aumentado para o estágio desejado e analisadas para os efeitos de quaisquer perturbações experimental. Este método de transferência de anfitrião tem sido altamente eficaz em descobrir mecanismos básicos do desenvolvimento inicial e permite uma ampla gama de possibilidades experimentais não disponíveis em qualquer outro organismo vertebrado modelo.

Protocolo

1. Remoção cirúrgica do tecido do ovário

1. Prepare um novo lote de meio de cultura de oócitos (OCM; Materials), entre 400-800 mL, dependendo do tamanho do experimento. Ajustar o pH a 7,6-7,8, até que o vermelho de fenol tem uma cor vermelho escuro (seis ou mais pequenas gotas de 5N NaOH). Derramar uma pequena quantidade para verificar o pH em um tubo separado desde o eletrodo de pH pode contaminar os meios de comunicação. OCM deve ser armazenado a 18 ° C e utilizada dentro de uma semana.
2. Selecione 3-5 fêmeas e um lugar em ~ 2L solução anestésica buffered (Materiais). Tentamos evitar o uso de rãs que foram alimentadas no dia ou antes ....

Discussão

A transferência bem sucedida irá resultar na fertilização e clivagem normal de> 50% dos oócitos (Figura 3). Geralmente entre 30-60% dos oócitos transferidos sobreviverá após os estágios nêurula. Nós normalmente transferência 75-150 oócitos por grupo experimental, que vai produzir embriões suficientes para vários tipos de análise (in situ, RT-PCR), bem como visualizar o fenótipo. Implantação de ovócitos substancialmente mais não parece aumentar significativamente o rendimento. Além disso, pelo menos 30 oócitos por gru.......

Materiais

Soluções e receitas:

OCM (meio de cultura de oócitos; modificado a partir Wylie et al, 1996).

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
70% L-15 Leibovitz de médio (contendo L-Glutamina)	(Invitrogen 11415-064)
0,4 mg / ml de albumina bovina sérica (BSA; V fração)	(Sigma A-9418-50g)
1x penicilina-estreptomicina	(Sigma P-0781)
Ajuste para 7,6-7,8 pH com NaOH 5N
Fazer nova loja, semanal a 18 ° C.

MMR 10X (solução modificada de Marc Ringer;. Zuck et al, 1998)

1M NaCl
20 mM KCl
20 mM CaCl 2
10 mM MgCl 2
HEPES 150 mM
ajustar o pH 7,6-7,8
Armazenar a 4 ° C

Solução anestésica

1 g / L 3-aminobenzóico Ethyl Ester (MS222)	(Sigma A-5040)
Bicarbonato de sódio 0,7 g / L
Dissolver em água tratada Amquel-
Faça fresco semanal

Stocks de progesterona

Progesterona 10 mM (Sigma P-0130) em etanol 100%
Diluir a 1 mM em etanol 100% para um estoque 500x solução / trabalho
Armazenar a -20 ° C

Corantes vitais (modificado de Heasman et al., 1991)

Azul: 0,1% Nilo Azul A	(Aldrich 121.479-5G),
Vermelho: 0,25% Vermelho Neutro	(Sigma N-6634),
Brown: 1% Bismarck Brown	(Sigma B-2759),
Verde (80 mL + 80 azul castanho mL),
Malva (80 vermelho azul + 80 mL mL).
A cor sexta, Orange (80 mL vermelho + 80 mL marrom), também pode ser usado, mas é muitas vezes difícil de distinguir de castanho.

Estoques de azul, vermelho e marrom são compostos em água deionizada em tubos de 50 ml, incubadas por 20 minutos com balanço e fiado em uma centrífuga clínica. Os sobrenadantes são aliquotado em tubos de microcentrífuga e armazenadas a -20 ° C.