Dissecção do Organizador e Explantes Pólo animal a partir de embriões Xenopus laevis e Montagem de um ensaio de Adesão Celular

Resumo

Este vídeo demonstra a técnica utilizada para a preparação de organizador e explantes pólo animal a partir de embriões Xenopus laevis, incluindo o uso da faca sobrancelha - uma ferramenta de dissecção especializados feitos da própria sobrancelha. O protocolo para a montagem de um ensaio de aderência também é dado, que investiga para a presença de moléculas de adesão chave presentes na superfície ou organizador de células animais pólo que são críticos para o desenvolvimento adequado.

Protocolo

Preparando Chambers Adesão (um dia antes da injecção / dissecção)

Ensaio de aderência Chambers

Se você tem um microscópio composto convencional (óptico localiza acima do palco), é ncecessary para fazer uma baixa altura câmara de adesão da seguinte forma. Se estiver usando o microscópio invertido óptica, então "NUNC Lab-Tek lamela Chambered" pode apenas ser usado, e ignore as etapas # 1 - 2.

1. Anexar um dos "press-to-vedação isolante de silicone" em uma lamínula 40 x 24mm. Pressione firmemente o isolador para a lamínula na bancada limpa e olhar do outro lado para certificar-se que o isolante é completamente ligado sem-bolhas de ar.
   
   
2. Opcional: Coloque as câmaras de adesão em uma placa de Petri de vidro com papel de filtro Whatman e autoclave no ciclo de seca para esterilizar. Resfriá-los para baixo para RT.

Revestimento da Câmara

1. Coloque uma gota de 200ml de solução de trabalho de caderina (10mg/ml) ou fibronectina (20mg/ml) para o centro de uma câmara de adesão autoclavada, utilizando sigmacoated dicas amarelo. Incubar a RT por 4 horas.
   
   
2. Retire a solução caderina ou fibronectina e transferir para um tubo de 1,5 ml. Esta solução pode ser reutilizado para próximas duas semanas.
   
   
3. Dispense 500ml de BSA 4% em 1x MBS-H para bloquear a câmara. Incubar a RT por 1 hora.
   
   
4. Aspirar a solução de BSA. Lave a câmara com 500ml de 1x MBS-H duas vezes. Depois da segunda lavagem, aspirar a maioria dos MBS-H (não completamente), e armazenar em um recipiente fechado a 4 º C. Esta câmara de adesão é bom para os dois próximos - 3 dias.

Dissecção e dissociação de explantes Cap animal

1. Incubar os embriões injetados em 0,1 x MBS-H, diluídos a partir do 1x autoclavado MBS-H, como não-autoclavado médio sometime carrega germes pouco que pode perturbar as células cap dissociada animal.
   
   
2. Faça agarose 1x Barth e placas CMF-MBS agarose com pratos 60mm, pelo menos tantos como o número de suas amostras. Despeje autoclavado 1x MBS-H para placas 1x Barth. Para placas MBS-CMF, despeje 10ml de CMF-MBS.
   
   
3. Quando os embriões tornam-se palco 8,5, iniciar dissecar as tampas de animal em uma placa de Barth 1x. 10-15 explantes por amostras são geralmente suficiente para uma experiência.
   
   
4. Transferir os explantes cap animal para uma placa CMF-MBS. Incubar os explantes de 45-60 minutos, até que os explantes são completamente dissociados. Agitações suave em cada 15 minutos vai ajudar a dissociação.

Ensaio de adesão celular

1. Semeadura das células: Dispense 500ml de 1x MBS-H para a câmara de adesão preparada nas etapas nas seções acima, Chambers Ensaio de Adesão e revestimento da Câmara. Transferência das células animais cap dissociada da placa CMF-MBS para a câmara de adesão usando P200 com dicas sigmacoated e picados-off amarela.
   
   
2. Opcional: Se possível, cuidadosamente sugar até o meio até aproximadamente 2 / 3 para metade, sem expor as células para o ar. Adicionar aproximadamente a mesma quantidade de doce MBS-H, para se certificar de que o meio contém suficientes Ca ^{2 +} e Mg ^{2 +.}
   
   
3. Incubar a RT para 45-90 minutos. Verifique as células ocasionalmente para ver se eles são inerentes a superfície inferior.
   
   
4. Agora você pode tirar a foto das células sob um microscópio.
   
   
5. Coloque a câmara de aderência em um copo de slides grid. Alinhar um dos cantos da câmara de adesão a um canto do slide grid. Contar e registrar o número de células associadas em diversas redes diferentes.
   
   
6. Despeje 1L de MBS-H em um balde grande de plástico (por exemplo, Tupperware, etc.) Com cuidado, coloque a câmara de slides adesão ao fundo do balde. Girá-lo no agitador orbital por cinco minutos em baixa velocidade (50 - 60rpm).
   
   
7. Coloque a câmara de adesão de volta no slide grid, alinhando o mesmo canto da câmara para o mesmo canto do slide grid, como foi feito no passo 5 desta seção Ensaio de Adesão, Cell. Contar o número de células que permanecem ligados na mesma grelha que você tem contado antes da lavagem. Calcular a porcentagem de células que permanecem ligados após a lavagem.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
1x MBS-H	Tampão			Barth Modificado’s médio: receita para 1 L: 5,14 g de NaCl, 75 mg de KCl, 0,2 g de NaHCO₃3 0,2 g de MgSO₄4•7H2O 60 mg de CaCl2•2H2O 80 mg Ca(NO3)2•4H2O2. 38 g de HEPES, ácido livre Ajuste o pH para 7,4 com NaOH. Autoclave.
CMF-MBS	Tampão			Este é o Ca2+/Mg2+-versão livre de MBS-H. Receita de 500 mL: 2,57 g de NaCl, 37,5 mg de KCl, 0,1 g de NaHCO₃3/sub> 1,19 g de HEPES, ácido livre. Ajuste o pH para 7,4 com NaOH. Autoclave.
1% agarose/1x Barth’placas s				tantos quanto o número de amostras
placas de 1% agarose/MBS-CMF				tantos quanto o número de amostras
E-Caderina/Fc quimérica	Reagente	Sigma-Aldrich	E-2278	Dissolva 0,1 mg de E-caderina sólida em 100 μl de MBS-H 1x contendo 40% de glicerol para obter um estoque-mãe 100x (1,0 mg/ml). Armazene-o em –20 °C. Faça uma diluição 1/100 com MBS-H 1x para obter uma solução trabalho de 10 μg/ml logo antes de usar. Você precisará de 200 μl dessa solução trabalho por amostra.
Fibronectina, solução a 0,1%	Reagente	Sigma-Aldrich	F-1141	Esta solução pré-pronta pode ser usada como estoque 50x. Faça uma diluição 1/50 com MBS-H 1x para preparar 20 μsolução trabalho de g/mL logo antes de usar. Você precisa de 200 μL por amostras desta solução de trabalho. NÃO recomendo o uso de Fibronectina sólida, porque é difícil dissolvê-la na concentração de 0,1% para preparar a solução estoque. Embora seja mais cara, essa solução pronta de 0,1% é preferível para obter resultados consistentes.
4% BSA /MBS-H	Tampão			BSA: fração V grau biologia molecular
pontas amarelas Sigmacoted	Ferramenta
Lâminas de cobertura nº 1				40 mm x 24 mm ou 60 mm x 24 mm
Isolador de silício com vedação por pressão	Ferramenta	Glace Bio-Labs	JTR20-2.5	2,5 mm de profundidade x 20 mm de diâmetro
NUNC Lab-Tek Chambered Coverglass	Ferramenta	Fisher Scientific	12-565-471	2 poços/lâminas
Lâmina de vidro com grade	Ferramenta			ou retículo do Finder para contagem de células