Este vídeo demonstra a técnica utilizada para a preparação de organizador e explantes pólo animal a partir de embriões Xenopus laevis, incluindo o uso da faca sobrancelha - uma ferramenta de dissecção especializados feitos da própria sobrancelha. O protocolo para a montagem de um ensaio de aderência também é dado, que investiga para a presença de moléculas de adesão chave presentes na superfície ou organizador de células animais pólo que são críticos para o desenvolvimento adequado.
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Artigo de método
Dissecção do Organizador e Explantes Pólo animal a partir de embriões Xenopus laevis e Montagem de um ensaio de Adesão Celular
Neste artigo
Resumo
Protocolo
Preparando Chambers Adesão (um dia antes da injecção / dissecção)
Ensaio de aderência Chambers
Se você tem um microscópio composto convencional (óptico localiza acima do palco), é ncecessary para fazer uma baixa altura câmara de adesão da seguinte forma. Se estiver usando o microscópio invertido óptica, então "NUNC Lab-Tek lamela Chambered" pode apenas ser usado, e ignore as etapas # 1 - 2.
- Anexar um dos "press-to-vedação isolante de silicone" em uma lamínula 40 x 24mm. Pressione firmemente o isolador para a lamínula na bancada limpa e olhar do outro lado para certificar-se que o isolante é completamen....
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários | |
|---|---|---|---|---|
| 1x MBS-H | Tampão | Barth Modificado’s médio: receita para 1 L: 5,14 g de NaCl, 75 mg de KCl, 0,2 g de NaHCO₃3 0,2 g de MgSO₄4•7H2O 60 mg de CaCl2•2H2O 80 mg Ca(NO3)2•4H2O2. 38 g de HEPES, ácido livre Ajuste o pH para 7,4 com NaOH. Autoclave. | ||
| CMF-MBS | Tampão | Este é o Ca2+/Mg2+-versão livre de MBS-H. Receita de 500 mL: 2,57 g de NaCl, 37,5 mg de KCl, 0,1 g de NaHCO₃3/sub> 1,19 g de HEPES, ácido livre. Ajuste o pH para 7,4 com NaOH. Autoclave. | ||
| 1% agarose/1x Barth’placas s | tantos quanto o número de amostras | |||
| placas de 1% agarose/MBS-CMF | tantos quanto o número de amostras | |||
| E-Caderina/Fc quimérica | Reagente | Sigma-Aldrich | E-2278 | Dissolva 0,1 mg de E-caderina sólida em 100 μl de MBS-H 1x contendo 40% de glicerol para obter um estoque-mãe 100x (1,0 mg/ml). Armazene-o em –20 °C. Faça uma diluição 1/100 com MBS-H 1x para obter uma solução trabalho de 10 μg/ml logo antes de usar. Você precisará de 200 μl dessa solução trabalho por amostra. |
| Fibronectina, solução a 0,1% | Reagente | Sigma-Aldrich | F-1141 | Esta solução pré-pronta pode ser usada como estoque 50x. Faça uma diluição 1/50 com MBS-H 1x para preparar 20 μsolução trabalho de g/mL logo antes de usar. Você precisa de 200 μL por amostras desta solução de trabalho. NÃO recomendo o uso de Fibronectina sólida, porque é difícil dissolvê-la na concentração de 0,1% para preparar a solução estoque. Embora seja mais cara, essa solução pronta de 0,1% é preferível para obter resultados consistentes. |
| 4% BSA /MBS-H | Tampão | BSA: fração V grau biologia molecular | ||
| pontas amarelas Sigmacoted | Ferramenta | |||
| Lâminas de cobertura nº 1 | 40 mm x 24 mm ou 60 mm x 24 mm | |||
| Isolador de silício com vedação por pressão | Ferramenta | Glace Bio-Labs | JTR20-2.5 | 2,5 mm de profundidade x 20 mm de diâmetro |
| NUNC Lab-Tek Chambered Coverglass | Ferramenta | Fisher Scientific | 12-565-471 | 2 poços/lâminas |
| Lâmina de vidro com grade | Ferramenta | ou retículo do Finder para contagem de células |
Reimpressões e permissões
