Demonstramos um protocolo para gerar embriões quiméricos zebrafish para o comportamento imagens ao vivo do celular durante a embriogênese.
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Artigo de método
Transplante de GFP-expressando Blastômeros for Imaging ao vivo de Desenvolvimento da retina e do cérebro em embriões Zebrafish Quimérico
Neste artigo
Resumo
Resumo
Células mudam extensivamente em seus locais e dos bens durante a embriogênese. Essas alterações são reguladas pelas interações entre as células e seu meio ambiente. Embriões quiméricos, que são compostas de células de fundo genético diferente, são ótimas ferramentas para estudar as interações célula-célula mediada por genes de interesse. A transparência embrionário de zebrafish em fases iniciais de desenvolvimento permite a visualização direta da morfogênese de tecidos e órgãos em nível celular. Aqui, nós demonstramos um protocolo para gerar retinas quimérico e cérebros em embriões de peixe-zebra e para realizar imagens ao vivo das células do doador. O protocolo abrange a preparação de agulhas transplante, o transplante de GFP-expressando blastômeros doadores para GFP-negativos hosts, eo exame do comportamento dos doadores de células sob microscopia confocal ao vivo. Com pequenas modificações, este protocolo também pode ser usado para estudar o desenvolvimento embrionário de outros tecidos e órgãos em peixes-zebra. As vantagens de usar a GFP para as células do doador rótulo também são discutidos.
Protocolo
Dia 1. Preparação
1. Configurar atravessa peixes
Configurar cruza pairwise de peixe-zebra da noite. Para evitar acasalamento ao acaso antes do tempo desejado, use divisórias para separar o peixe do sexo feminino e masculino nas cassetes de acasalamento. Expressando GFP-peixes transgénicos são usados como fonte de blastômeros doador. A linhagem transgênica pt104 (Zou et al., 2008), usado aqui, expressa ubiquitously GFP sob o controle do promotor EF1. Expressão GFP permite a visualização de células do doador por imagem ao vivo. Outras linhas de peixes transgénicos que expressam proteínas fluorescentes adeq....
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Discussão
Neste vídeo, demonstramos um método para blastômero transplante para analisar o desenvolvimento da retina e do cérebro em zebrafish. Este protocolo também pode ser usado para analisar o desenvolvimento de outros tecidos e órgãos, simplesmente liberando a blastômeros de doadores para os locais correspondentes nos embriões host. A rotulagem com as moléculas de GFP rende um aspirador de fundo do que a marcação com corante fluorescente conjugada Dextran (Ho e Kane, 1990). Isto é porque os restos de tintas Dextran a partir d.......
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Agradecimentos
Este estudo foi apoiado por um dos Institutos Nacionais de Saúde (NIH) Core Grant (5P30EY008098) e os fundos a seguir para XW: Grant NIH R01EY016099 e Pesquisa para prevenir a cegueira Prêmio de Desenvolvimento de Carreira. Agradecemos a Lathrop Kira de assistência em imagem confocal.
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Materiais
E3 água ovo:
- 5 mM NaCl
- 0,17 mM KCl
- 0,33 mM CaCl 2
- 0,33 mM MgSO 4
- Azul de metileno 0,1%
Referências
- Zou, J., Lathrop, K., Sun, M., Wei, X. Intact RPE maintained by Nok is essential for retinal epithelial polarity and cellular patterning in zebrafish. Journal of Neuroscience. 28 (50), 13684-13695 (2008).
- Westerfield, M. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). TH....
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Reimpressões e permissões
