Injeções intratraqueais solutos entregar diretamente para os pulmões. Este procedimento visa a entrega do instillate nas regiões distais do pulmão, e é, portanto, muitas vezes incorporadas em estudos que visam estudar alvéolos. Nós fornecemos um protocolo de sobrevivência detalhadas para a realização de injeções intratraqueais em camundongos.
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Artigo de método
Instilação traqueal direta de Solutos em pulmão de rato
Neste artigo
Resumo
Resumo
Injeções intratraqueais solutos entregar diretamente para os pulmões. Este procedimento visa a entrega do instillate nas regiões distais do pulmão, e é, portanto, muitas vezes incorporadas em estudos que visam estudar alvéolos. Nós fornecemos um protocolo de sobrevivência detalhadas para a realização de injeções intratraqueais em camundongos. Usando essa abordagem, pode-se planejar a distribuição de solutos teste ou sólidos (como terapêutica de pulmão, surfactantes, vírus e oligonucleotides pequeno) para o pulmão distal. Instilações traqueal pode ser a metodologia preferida, através de protocolos que podem inalação alvo principalmente o trato respiratório superior e, possivelmente, expor o investigador a substâncias potencialmente perigosas. Além disso, ao utilizar o protocolo instilação traqueal, os animais podem se recuperar totalmente do procedimento não-invasivo. Isto permite fazer medições fisiológicas subseqüentes em animais de teste, ou reinstalação usando o mesmo animal. A quantidade de instillate introduzido no pulmão deve ser cuidadosamente determinada e osmoticamente balanceada para garantir a recuperação de animais. Tipicamente, 30-75 mL de volume instillate pode ser introduzida no pulmão do rato.
Protocolo
1. Anestesia
- Anestesiar ratos com isoflurano pode facilitar o manuseio e contenção de animais antes de administrar anestesia intraperitaneally. Utilizando um anestésico inalado pode ou não ser adequado para um estudo particular: primeiro determinar o impacto do uso de isoflurano, ou qualquer outro anestésico, no estudo do pulmão proposto.
- Anestesiar animais com isoflurano. O vídeo mostra o uso de uma câmara de vaporizador isoflurano fixado em 2% de isoflurano misturado com oxigênio. Se você não tem uma câmara de isoflurano, pode, alternativamente, usando técnicas abrir-drop exposição. Coloque ratos em uma redoma de vidro (ou outro recipiente não-porosas apropriadas) com uma malha de aço montados para o fundo. A uma compressa de gaze colocado sob o fio de malha, aplicar uma mistura de 30% v / v isoflurano em propilenoglicol. O uso da malha garante que o animal não entrar em contacto com a almofada de isoflurano encharcado, o que pode causar irritação na pele e uma overdose potencial. Após a exposição curta para o isoflurano, o animal deve ser anestesiado e não responderá com um reflexo de endireitamento quando o frasco é derrubado e não responderá após pitada dedo do pé.
- Camundongos mais tranqüilo com uma injeção intra-peritoneal de uma mistura de xilazina e quetamina. (É uma boa prática ao realizar injeções intraperitoneais de chamar de volta para garantir que porções do intestino ou outros órgãos vitais não foram penetrados). Mix 150 Xilazina mL (100 mg / mL) com 1000 mL ketamina (100 mg / mL) em 8850 mL de 0,9% de fosfato estéril salina tamponada (PBS). Para ratos, a dose será de aproximadamente 80 mL por 10 g de peso corporal. A concentração final será de 10 Xilazina mg / Kg e 100 Ketamina mg / kg. Os animais devem ser mantidos secos e isolados para evitar a perda excessiva de calor corporal. Pomada oftálmica pode ser aplicada para os olhos para evitar a secagem das córneas.
2. Preparação da Área Cirúrgica
- Raspar a área onde a incisão cirúrgica será feita evita a contaminação de áreas não-preparado. Um barbeador elétrico pode intimamente raspar o pêlo fora do animal. A área depilada deve ser maior do que o local da incisão.
- Posterior aplicação de creme de depilação, como Nair, irá remover todos os pêlos restantes. Aplicar uma espessa camada de creme de depilação para a área cirúrgica e deixe por 3 minutos. Limpe a pele e creme de depilação com uma toalha úmida. Não deixe o creme de depilação em mais de 10 minutos.
- Uso de álcool 70%, ou esfregue uma solução alternativa, para assepticamente preparar a área cirúrgica.
3. Procedimento Cirúrgico
- A posição do animal anestesiado em uma placa inclinada cirúrgico, ou ficar de restrição angular.
- Fazer uma pequena incisão perto da face anterior do pescoço (região da garganta).
- Dissecar afastado o platisma e músculos anterior da traquéia, a fim de visualizar e acessar os anéis traqueais.
- Normalmente, os volumes de injeção intratraqueal são 3 gramas por mL de peso (cerca de 30-75 mL de volume final). Administrar a quantidade adequada de instillate usando um subcutânea 1ml (sub-Q) seringa com uma calibre 30, agulha 5/16-inch. Segure o lado bisel seringa para cima e paralela com a traquéia, e injetar o volume total de instillate na traquéia.
- O animal pode responder por ofegante após a instilação de soluto para os pulmões. Introdução de ar através da seringa e observando se os pulmões expandem também confirmará técnicas de intubação com sucesso.
- Retire a seringa da traquéia.
4. Suturas.
- Segure swage da agulha (parte mais grossa da agulha onde o material de sutura é anexado) com um suporte de agulha.
- Penetram na pele com a ponta da agulha em um ângulo de 90 ° aproximadamente 1-3 milímetros de distância da borda da ferida, dependendo da espessura da pele. Segure a agulha sair após uma passagem através do tecido. Pontos simples, individualmente atado, será eficiente fechar a ferida.
5. Recuperação de Animais
- Os animais devem se recuperar totalmente da anestesia e procedimento cirúrgico após 24/03 horas.
6. Resultados representante
Instilação intratraqueal de composto fluorescente, Cy5.5 conjugado com dextran, mostra a instilação de sucesso de compostos fluorescentes em B6 pulmão mouse (Figura 1). O corante fluorescente é dirigido principalmente para o pulmão e é uniformemente distribuída. Sinal fluorescente no trato gastrointestinal imediatamente após o procedimento indica que o esôfago foi inadvertidamente intubados durante o procedimento (Figura 2). Os investigadores também podem verificar de entrega prevista para compostos no pulmão, e verificar a distribuição dos instillate, seguindo o procedimento por inflar os pulmões e preparar fatias de tecido pulmonar (2, 3) ou fixas histoloamostras tecnológico.
Figura 1. Fluorescente Cy5.5 sinal co-registrada com X-ray imagem no pulmão do rato com sucesso instilado. 1,4 mg Cy5.5 Dextran (a uma concentração de 10 mcg / mL) foi instilado na traquéia de B6 pulmão mouse. Cy5.5 sinal foi detectado através de um filtro de 675 nm de excitação e um filtro de emissão de 695 nm.
Figura 2. Co-registro de sinal fluorescente mostrado com raios-X em sobreposição do mouse mal instilado. Intubação inadequado do esôfago durante a instilação traqueal resultados protocolo em Cy5.5 de entrega para o intestino.
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Discussão
Injeções intratraqueais têm sido utilizados em vários vários estudos para avaliar a toxicidade de compostos de teste (6), induzir a lesão pulmonar alveolar (4, 7), substituir surfactantes (8), bem como alterar a expressão de genes através de entrega de pequenos oligonucleotides diretamente no pulmão (5). Estamos atualmente explorando o uso de instilar 1) material redox-sensíveis fluorescentes para o pulmão, a fim de medir o estresse oxidativo in vivo em condições normais e fisiopatológicas, assim como 2) incutir indicad...
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Agradecimentos
Este trabalho foi financiado pelo NIH K99 HL09222601 eo S & R Foundation Award Ryaji Uneo concedido a MNH.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Isoflurano | Webster Veterinary | 14043-220-05 | |
| Xilazina | Lloyd, Inc. | Novo Aplicativo de Medicamento Veterinário #139-236 | |
| Ketamina | Bioniche Pharma | 67457-001-10 | |
| Nair | Disponível em farmácias | ||
| Seringa SubQ de 1 mL | BD Biosciences | 309597 | 26 5/8 G |
| Sutura de Nylon 4-0 | Ethicon Inc. | 1894G.S30 |
Referências
- Driscoll, K. E., Costa, D. L., Hatch, G., Henderson, R., Oberdorster, G., Salem, H., Schlesinger, R. B. Intratracheal instillation as an exposure technique for the evaluation of respiratory tract toxicity: uses and limitations. Toxicol Sci. 55, 24-35 (2000).
- Helms, M. N., Jain, L., Self, J. L., Eaton, D. C. Redox regulation of epithelial sodium channels examined in alveolar type 1 and 2 cells patch-clamped in lung slice tissue. J Biol Chem. 283, 22875-22883 (2008).
- Helms, M. N., Self, J., Bao, H. F., Job, L. C., Jain, L., Eaton, D. C. Dopamine activates amiloride-sensitive sodium channels in alveolar type I cells in lung slice preparations. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 291, L610-L618 (2006).
- Iyer, S. S., Ramirez, A. M., Ritzenthaler, J. D., Torres-Gonzalez, E., Roser-Page, S., Mora, A. L., Brigham, K. L., Jones, D. P., Roman, J., Rojas, M. Oxidation of extracellular cysteine/cystine redox state in bleomycin-induced lung fibrosis. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 296, L37-L45 (2009).
- Li, T., Folkesson, H. G. RNA interference for alpha-ENaC inhibits rat lung fluid absorption in vivo. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 290, L649-L660 (2006).
- Sager, T., Porter, D., Robinson, V., Lindsley, W., Schwegler-Berry, D., Castranova, V. An improved method to disperse nanoparticles for in vitro and in vivo investigation of toxicity. Nanotoxicol. 1, 118-129 (2007).
- Xu, J., Gonzalez, E. T., Iyer, S. S., Mac, V., Mora, A. L., Sutliff, R. L., Reed, A., Brigham, K. L., Kelly, P., Rojas, M. Use of senescence-accelerated mouse model in bleomycin-induced lung injury suggests that bone marrow-derived cells can alter the outcome of lung injury in aged mice. J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 64, 731-739 (2009).
- Yeh, T. F., Lin, H. C., Chang, C. H., Wu, T. S., Su, B. H., Li, T. C., Pyati, S., Tsai, C. H. Early intratracheal instillation of budesonide using surfactant as a vehicle to prevent chronic lung disease in preterm infants: a pilot study. Pediatrics. 121, e1310-e1318 (2008).
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Reimpressões e permissões
