Geração de esferóides a partir de linhagens celulares: um método de cultura celular tridimensional (3D)

Resumo

Fonte: Dillard, P., et al. Um ensaio de morte de esferóides por células T CAR. J. Vis. Exp. (2018).

Os esferoides são um tipo de modelo de cultura de células 3D usado para representar com mais precisão o ambiente de uma célula em comparação com os modelos de monocamada de cultura de células 2D. No protocolo de exemplo, veremos os cientistas gerarem esferóides a partir de uma linha de células de câncer colorretal e aplicarem imagens de células vivas para rastrear o crescimento dos esferoides.

Protocolo

1. Geração de esferoides da linha celular de câncer colorretal

1. Lave as monocamadas celulares de HCT 116 (transduzidas de forma estável para expressar Cluster of Differentiation 19 (CD19) e Green Fluorescence Protein (GFP)) com solução salina tamponada com fosfato (PBS; 5 mL para um frasco de 25 cm² ou 10 mL para um frasco de 75 cm²). Adicionar tripsina (0,5 ml para um balão de 25^cm2 ou 1 ml para um balão de 75^cm2) e incubar as células a 37 °C durante 5 min.
2. Verifique o descolamento celular ao microscópio e neutralize a enzima de dissociação celular com meio completo do Roswell Park Memorial Institute 160 (RPMI 1640) (RPMI 1640 + 10% FCS + gentamicina; 10 mL para um frasco de 25 cm² ou 20 mL para um frasco de 75 cm²).
3. Centrifugue a suspensão da célula a 500 x g por 5 min. Remova o sobrenadante usando uma pipeta e ressuspenda pipetando para cima e para baixo várias vezes com 5 mL de meio RPM1 1640 completo.
4. Conte as células usando a exclusão azul de Trypan em um contador de células compatível.
5. Centrifugue a suspensão da célula a 500 x g por 5 min. Remova o sobrenadante usando uma pipeta e ressuspenda em meio RPMI para obter 5 x 10³células / mL.
6. Cubra uma placa inferior redonda de 96 poços com 100 μL / poço de 100 μg / mL de poli-L-lisina (PLL) em PBS durante 1 hora em temperatura ambiente. Lave duas vezes com PBS e deixe o prato secar.
7. Transfira a suspensão celular para um reservatório estéril e dispense 200 μL/poço nas placas de fundo redondo de 96 poços revestidas com PLL usando uma pipeta multicanal.
8. Transferir a placa para o aparelho de imagiologia automático dentro de uma incubadora (37 °C, 5% CO₂, 95% de humidade).
9. Faça login no software de aquisição, selecione Agendar para adquirir | Lançar Adicionar embarcação | Digitalizar na programação | Criar embarcação: Novo.
10. Selecione Tipo de digitalização: Esferoid. Selecione os canais de interesse: Fase + Campo Claro (para acompanhar o crescimento dos esferoides), Verde (para seguir o sinal do tumor, tempo de aquisição de 300 ms) e Vermelho (para acompanhar a apoptose, tempo de aquisição de 400 ms).
    1. Selecione a ampliação desejada: 10x.
    2. Escolha o modelo da placa e sua posição na gaveta. Selecione a posição dos poços a serem visualizados. Insira a descrição do experimento: nome, tipo de células, número de células.
11. Para a configuração da análise, selecione Adiar análise até mais tarde. Clique com o botão direito do mouse na linha do tempo e selecione a opção Definir intervalo do grupo de varredura selecionadoe defina Adicionar varreduras a cada 4 h e Para um total de até 24 h. Defina a hora de início desejada (pelo menos 1 h após a incubação no aparelho de imagem automatizado).
12. Verifique a cada 2 dias o crescimento de esferoides fazendo login no software de imagem.
    1. Escolha a opção Exibir verificações recentes e clique duas vezes no experimento desejado. Selecione Campo claro no painel de canais de imagem e use a ferramenta Medir recursos de imagem para medir o diâmetro dos esferoides. Leva 6 dias para um esferóide atingir o tamanho desejado: 0,5 mm de diâmetro. Adicione 50 μL de meio RPMI completo por poço no dia 4 para limitar o efeito de evaporação do meio.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	SIGMA-ALDRICH	D8537-500ML	Número do lote: RNBG7037
75 cm² frascos de área de crescimento	VWR	430639	Número de lote: 2218002
75 cm² frascos de área de crescimento	VWR	734-2705	Número de lote: 3718006
Tripsina-EDTA	SIGM-ALDRICH	T3924-100ml	Número de lote: SLBTO777
RPMI 1640 med L-glutamina, 10 x 500 mL	Tecnologia da Vida (Gibco)	Rolamento 21875-091	Número de lote: 1926384
Gentamicina	Thermo Fischer	15750060	Número de lote: 1904924A
Solução de azul de tripano, 0,4%	Thermo Fischer	15250061	Número de lote: 1886513
96 placa de poço, fundo redondo	VWR	734-1797	Número de lote: 33117036
X-VIVO 15 com gentamicina L-Gln, vermelho de fenol, 1 L	BioNordika	BE02-060Q	Número de lote: 8MB036
Reservatório de reagentes	VWR	89094-672	Número de lote: 89094-672
tubos de 15 mL	VWR	734-1867	Número de lote: 19317044
Fetal Soro Bovino	Gibco	10500064	Número de lote: 08Q3066K
HCT 116 Linha de Carcinoma Colorretal	ATCC	CCL-247	-
Incucyte S3	Biociência de Essen