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Abstract

Fonte: Koemans, T. S., et al. Drosophila Condicionamento de namoro como medida de aprendizagem e memória. J. Vis. Exp. (2017).

Este vídeo descreve um ensaio de condicionamento clássico que testa o aprendizado e a memória em Drosophila, chamado condicionamento de namoro. O ensaio é baseado na redução do namoro masculino após sofrer uma rejeição por uma fêmea pré-acasalada não receptiva. O protocolo de exemplo mostra uma configuração para o procedimento que pode ser usada para avaliar a memória de curto e longo prazo.

Protocol

Este protocolo é um trecho de Koemans et al., Drosophila Courtship Conditioning As a Measure of Learning and Memory, J. Vis. Exp. (2017).

NOTA: No protocolo descrito abaixo, uma réplica de coleta, treinamento e teste é descrita. Para testar a reprodutibilidade dos resultados, essas etapas devem ser repetidas em paralelo, em vários dias e com grupos separados de moscas (Tabela 1). O protocolo é baseado em um ciclo de vida de 10 dias do ovo ao adulto, o que é normal ao criar moscas em condições constantes de 25 °C, 70% de umidade e um ciclo claro/escuro de 12 horas. Todos os aspectos deste protocolo pressupõem que as condições sejam mantidas constantes durante todo o ensaio. Os horários são indicados como horas antes do acendimento das luzes (BLO) ou após o acendimento das luzes (ALO) na incubadora, pois isso pode ser convenientemente definido dependendo da hora do dia preferida do pesquisador. Utilizar gás CO₂ apenas para a colheita inicial de moscas machos virgens e para a colheita de fêmeas pré-acasaladas. Este protocolo de condicionamento de namoro é composto pelas seguintes etapas:

1. Estabelecimento de culturas de coleção de fêmeas pré-casadas
2. Estabelecimento de culturas para a coleta de cobaias do sexo masculino
3. Preparação de blocos habitacionais
4. Estabelecimento de frascos de acasalamento para a produção de fêmeas pré-acasaladas padronizadas
5. Coleção de cobaias masculinas
6. formação
7. teste
8. Análise de dados e estatísticas de vídeo

1. Estabelecimento de culturas de coleção de fêmeas pré-acasaladas

1. Prepare powerfood. Ferva 0,8% (p/v) de ágar, 8% (p/v) de fermento, 2% (p/v) de extrato de levedura, 2% (p/v) de peptona, 3% (p/v) de sacarose, 6% (p/v) de glicose, 0,05% (p/v) de MgSO₄ e 0,05% (p/v) de CaCl₂ em água por 15 min. Deixe a solução esfriar a 70 ° C antes de adicionar 0,05% (p / v) de metilparabeno (CUIDADO: tóxico) e 0,5% (v / v) de ácido propiônico (CUIDADO: tóxico). Homogeneizar bem, mexendo e arrefecendo até 50 °C, para obter uma solução homogénea.
2. Antes que os alimentos solidifiquem à temperatura ambiente, adicione ~ 50 mL de powerfood a cada frasco de plástico de 175 mL. Deixe os alimentos esfriarem ainda mais. Feche o frasco com um plugue.
   OBSERVAÇÃO: Powerfood é uma mistura alimentar especializada formulada especificamente para a produção de um grande número de moscas, presumivelmente induzindo a postura de ovos. Powerfood não é usado para produzir moscas machos que serão usadas para análise de comportamento (etapa 2) porque a dieta atípica e a potencial aglomeração podem influenciar o desenvolvimento.
3. No dia -11 (Tabela 1), inicie 5-20 culturas selvagens com aproximadamente 60-100 moscas (uma mistura de machos e fêmeas) em frascos de powerfood; estes serão usados na etapa 4 para produzir fêmeas pré-acasaladas padronizadas. Adicione um papel de filtro a cada frasco para aumentar a área sobre a qual as larvas podem pupar; Isso aumentará o número de moscas que podem fechar.
4. Repita periodicamente as etapas 1.1-1.3 ao longo do experimento para obter moscas recém-fechadas suficientes como entrada para o “estabelecimento de frascos de acasalamento para a produção de fêmeas pré-acasaladas padronizadas” (etapa 4).

2. Estabelecimento de culturas para a coleta de cobaias do sexo masculino

1. Prepare alimentos normais, feitos com 0,5% (p/v) de ágar, 2,75% (p/v) de fermento, 5,2% (p/v) de farinha de milho, 11% (p/v) de açúcar, 0,05% (p/v) de metilparabeno e 0,5% (v/v) de ácido propiônico em água, conforme descrito nas etapas 1.1 e 1.2. Feche os frascos de plástico de 175 mL com um tampão para frascos para moscas.
2. No dia -10 (Tabela 1), coloque cerca de 10-20 machos com aproximadamente 30-75 fêmeas virgens (Tabela de Materiais/Equipamentos) em cada frasco de 175 mL contendo alimento normal. Adicione um papel de filtro para aumentar a área de superfície para pupação e maximizar a produtividade.
3. Estabelecer de três a seis frascos de 175 mL por genótipo para obter o número necessário de machos sujeitos ao teste.
   OBSERVAÇÃO: Mais frascos podem ser necessários, dependendo da produtividade do genótipo desejado.

3. Preparação de blocos habitacionais (Figura 2A)

1. Derreta aproximadamente 50 mL de powerfood por bloco de alojamento no micro-ondas ou prepare-o fresco.
2. Adicione 500 μL de powerfood a cada poço de um bloco de fundo plano de 96 poços usando uma pipeta multidispensadora.
3. Deixe os alimentos solidificarem à temperatura ambiente.
4. Cubra os blocos com filme adesivo PCR e use uma agulha para fazer pelo menos 4 furos por poço para fornecer ar fresco às moscas.
5. Para poder abrir cada poço, use uma lâmina de barbear para cortar o filme adesivo longitudinalmente entre cada linha. Deixe o filme intacto em uma extremidade do bloco.
6. Os blocos podem ser armazenados a 4 °C por até 2 dias.
   OBSERVAÇÃO: Deixe os blocos se reequilibrarem à temperatura ambiente antes de usar.

4. Estabelecimento de frascos de acasalamento para a produção de fêmeas pré-acasaladas padronizadas

1. No dia -1, remova e descarte todas as moscas selvagens adultas de culturas de coleta de fêmeas pré-acasaladas em 2-5 h BLO.
2. Colete moscas usando o aspirador (Figura 2B) desses frascos em intervalos de 2 a 3 h (por exemplo, a 30 min, 2,5 h e 5 h ALO) e coloque-as em um novo frasco para injetáveis powerfood suplementado com uma pequena quantidade de pasta de fermento e papel de filtro.
3. Para evitar aglomeração e promover uma atmosfera de acasalamento ideal, não transfira mais de 150-200 moscas para cada novo frasco. Garanta o acasalamento de todas as fêmeas, fornecendo pelo menos 25% de machos. Certifique-se de que fêmeas suficientes estejam presentes nos frascos de acasalamento para acomodar o tamanho do experimento.
   OBSERVAÇÃO: Como esta é uma etapa crucial do protocolo, certifique-se de que apenas moscas recém-fechadas e nenhuma mosca, larva ou pupa velha sejam transferidas para o novo frasco de acasalamento.
4. Incube esses “frascos de acasalamento” por quatro dias para permitir tempo suficiente para que todas as fêmeas tenham acasalado.

5. Coleção de cobaias masculinas

1. No dia 1 (Tabela 1) a 2-3 h BLO, use CO₂ para remover todas as moscas adultas dos frascos de coleta machos (etapa 2), mas deixe mais moscas fecharem nas próximas horas.
2. Nas próximas 5-6 h, remova as moscas recém-fechadas a cada 20-30 min usando CO₂ e coloque cada macho em um poço individual do bloco de alojamento (etapa 3) usando o aspirador (Figura 2B).
3. Sele novamente o poço com o filme de PCR adesivo.
   OBSERVAÇÃO: Este é um passo crucial no protocolo. Os machos devem ser coletados com frequência. Os machos coletados devem ser isolados no bloco habitacional próximo ao momento da eclosão, quando apresentam pigmentação pálida e presença de mecônio no abdome translúcido.
   OBSERVAÇÃO: O uso suave do aspirador permite a transferência de moscas; no entanto, o uso inadequado estressará as moscas, causando variação no ensaio (consulte a Discussão).
4. Procure coletar até 48 machos por genótipo. Isso fornece um pequeno excesso ao número máximo de machos necessários para a análise de condições ingênuas e treinadas, permitindo alguma perda durante as etapas posteriores da transferência.

6. Treinamento

1. Remover as moscas do frasco para injetáveis de acasalamento (passo 4.2) utilizando CO₂ e separar as fêmeas pré-acasaladas dos machos.
2. Usando o aspirador, adicione uma única fêmea anestesiada e pré-acasalada a cada poço em uma fileira de um novo bloco de alojamento.
3. Usando o aspirador e sem anestesia, transfira um macho ingênuo individual do bloco de alojamento configurado na etapa 5.2 para o poço contendo uma fêmea pré-acasalada. Depois que o macho for colocado no poço, feche imediatamente com o filme adesivo; Não permita que o macho escape.
   OBSERVAÇÃO: Transfira moscas machos do aspirador para o bloco habitacional, aproveitando seu comportamento natural de “geotaxia negativa”.
4. Repita as etapas 6.2-6.3 até que pares masculinos e femininos suficientes sejam estabelecidos. Idealmente, estabeleça 24 pares, duas fileiras completas de um bloco habitacional, por genótipo. Deixe os homens ingênuos restantes no bloco habitacional original configurado na etapa 5.2.
5. Deixe os pares macho-fêmea intactos durante o período de treinamento (Tabela 2, Figura 1B).
   OBSERVAÇÃO: Durante esse tempo, o macho cortejará e será rejeitado pela fêmea pré-acasalada. Para aprendizagem e STM, o período de treinamento é de 1 h e para LTM, o período de treinamento é de 7 a 9 h.
6. Termine o treinamento (Tabela 2, Figura 1B) usando um aspirador para separar suavemente o macho da fêmea pré-acasalada; não use anestesia. Coloque o macho separado em um novo bloco habitacional.
7. Use o aspirador para transferir todos os homens virgens suavemente e sem anestesia do bloco de alojamento configurado na etapa 5.2 para um novo bloco de alojamento.
   OBSERVAÇÃO: Esta etapa é opcional para STM e aprendizado, mas é muito importante para LTM porque as moscas são alojadas por mais 24 horas para testar o LTM.
8. Para STM e LTM, deixe os machos descansarem por 1 h e ~ 24 h, respectivamente (Tabela 2, Figura 1B) antes do teste (etapa 7).
9. Para aprender, teste imediatamente os homens treinados e ingênuos (etapa 7).

7. Teste

1. Recolha as moscas dos frascos de acasalamento (passo 4.2) utilizando CO₂ e separe as fêmeas pré-acasaladas dos machos.
2. Deixe as fêmeas se recuperarem da anestesia por pelo menos 1 h em um frasco contendo comida normal.
3. Monte os gravadores de vídeo com antecedência (Figura 2C), para ter todo o equipamento pronto antes do início do teste.
4. Inicie o teste de acordo com os diferentes cronogramas de aprendizado, STM e LTM (Tabela 2, Figura 1B). Realize o teste imediatamente após o treinamento para aprendizado, 1 h após o treinamento para STM e 24 h após o treinamento para LTM.
5. Usando o aspirador, transfira suavemente um macho individual do bloco de alojamento em repouso ou do bloco de alojamento de treinamento se o aprendizado estiver sendo testado (passo 6.7, treinado; passo 6.8, ingênuo) para metade de uma arena de namoro com a divisória fechada (Figura 2D; consulte o Arquivo S1 para um plano de construção).
   OBSERVAÇÃO: O uso do comportamento natural de “geotaxia negativa” deve ser suficiente para transferir as moscas machos do aspirador para a arena de namoro.
6. Mova rapidamente, mas com cuidado, o orifício de entrada para a próxima arena e repita a etapa 7.5 até que todas as 18 arenas contenham um macho.
7. Usando o aspirador e sem CO₂, adicione uma fêmea pré-acasalada (coletada na etapa 7.2) à outra metade de todas as 18 arenas.
8. Coloque cuidadosamente a câmara de corte sob a câmera, com a abertura dos poços voltada para baixo (Figura 2C).
9. Remova a divisória das arenas para permitir a interação direta entre os machos e as fêmeas pré-acasaladas.
10. Comece imediatamente a gravar o comportamento por pelo menos 10 min.
    OBSERVAÇÃO: Ao usar uma configuração de duas câmeras, a gravação paralela de duas placas de namoro pode ser feita em intervalos de tempo sobrepostos para maximizar a eficiência.
11. Esvazie as arenas de namoro usando um aspirador de pó portátil e deixe a câmara de namoro ventilar antes de reutilizá-la.
12. Repita as etapas 7.4-7.11 até que o teste de todos os genótipos e condições (ou seja, ingênuos e treinados) tenha sido concluído.

8. Análise de dados de vídeo e estatística

1. Calcule o índice de namoro (IC), definido como a porcentagem de tempo que os machos cortejam durante os primeiros 10 minutos do período de teste, para cada mosca macho.
   OBSERVAÇÃO: Isso pode ser feito manualmente, observando o comportamento estereotipado do namoro (Figura 1A) ou usando um software de computador para quantificação automatizada do comportamento do namoro.
   OBSERVAÇÃO: Recomenda-se analisar 40-60 homens por condição ao longo de três dias para obter poder estatístico suficiente e julgar a consistência dos dados do IC.
2. Calcule o índice de aprendizagem (LI), definido como a redução percentual no IC médio de homens treinados em comparação com homens virgens (LI = (IC_ingênuo – IC_treinado) / IC_ingênuo). Avalie o LI para cada dia de teste e compare-o com o LI cumulativo calculado a partir de todos os dias de teste combinados.
3. Faça um arquivo de dados de tabulação de duas colunas separado com “Genótipo” e “CI” como cabeçalhos.
   OBSERVAÇÃO: Esses títulos diferenciam maiúsculas de minúsculas. O nome do genótipo para cada IC deve consistir em uma descrição do genótipo seguida por um sublinhado e a condição de treinamento (por exemplo, genotype_N e genotype_LTM, etc., onde N = ingênuo e LTM = memória de longo prazo; consulte o Arquivo Suplementar S2 para obter um exemplo). Essa anotação é essencial, pois a função analearn identificará moscas treinadas e ingênuas com base nos caracteres presentes após o primeiro sublinhado na coluna “Genótipo”.
4. Use o script analearn R (Arquivo Suplementar S3) para realizar um teste de randomização para julgar a significância estatística das diferenças entre os valores de LI de diferentes genótipos.
   1. Origine o script (Arquivo Suplementar S3) em R, que define uma função chamada “analearn.”
      OBSERVAÇÃO: A definição da função é: analearn <- function(nboot = 10.000, naivelevel = 'N', refmutation = NA, datname = NA, header = TRUE, seed = NA, writeoutput = TRUE).
   2. Inicie a função inserindo “analearn()” na linha de comando do R e selecionando o arquivo de dados a ser analisado (produzido na etapa 8.3) por meio da janela pop-up.
   3. Escolha a mutação de referência, que é o genótipo controle, digitando o número correspondente e pressionando enter.
      OBSERVAÇÃO: Depois de selecionar o genótipo de referência, o script leva vários segundos para executar 10.000 réplicas de bootstrap.
   4. Observe a tabela de saída (Tabela 3), que contém o genótipo, a condição de aprendizagem (ou seja, aprendizagem, STM ou LTM), o IC médio virgen, o IC médio treinado, o LI, a diferença entre o LI do controle em comparação com a condição experimental (LI dif), o limite inferior (LL) e o limite superior (UL) do intervalo de confiança de 95% do LI dif, e o valor de p indicando a probabilidade de não haver diferença significativa.
      NOTA: analearn armazenará um arquivo de texto de saída no diretório onde o arquivo de dados está localizado. No entanto, a tabela de saída também aparece no console do R-Studio. O nome padrão é construído com base no nome do arquivo de dados fornecido.
   5. Existem vários argumentos na função analearn que podem ser usados para alterar as configurações padrão da função para ajustar os parâmetros do bootstrapping.
      NOTA: “nboot” define o número de réplicas de bootstrap e é definido como 10.000 por padrão. Esse valor pode ser alterado para qualquer número inteiro maior que zero. A Tabela 5 lista vários argumentos que podem ser usados para alterar as configurações padrão da função. No entanto, não é recomendável usar dados produzidos com um número baixo de réplicas de bootstrap.

Representative Results

Materials

<em>P{KK101437}VIE-260B</em>	VDRC	101437	Dhat-at-RNAi in 60100 background
<em>P{KK108109}VIE-260B</em>	–	–	Control-RNAi in 60100 background (gift from K. Keleman)
<em>w+, UAS-dcr2/yhh;;elav-Gal4 (III)</em>	–	–	panneuronal driver line
Containers for plant tissue culture	VWR	960177	175 mL plastic vials
Folded filters	Whatman	10311643	Filter paper to enlarge area flies can pupate on
Flat-bottom blocks (96-wells)	Qiagen	19579	Used for housing blocks
MicroAmp Clear Adhesive Film	Applied Biosystems	4306311	PCR adhesive film as lid on flat-bottom blocks
Razor blade	–	–	Any sharp will do
Needle	–	–	0.8 mm diameter
Aspirator	–	–	Cut a 1mL pipet tip with scissors in order to have two pieces. The narrow tip of the pipettip is placed as fly entrance in a ~80 cm flexible hose. To prevent a fly from getting in the hose, a normal piece of cotton or small mesh gaze is placed in between the tip and the hose. The other half of the pipettip can be used as mouth piece at the end of the hose.
Courtship chambers	–	–	file S1 can be opened with indicated CAD software
Camcorder	Sony	–	camera specification: >4M pixels, full HD.
For manual quantification, any simple video recording device has the potential to produce a video of sufficient quality to observe courtship behavior accurately. For automated quantification, there will likely be different requirements depending on the software to be used, and users should investigate this thoroughly if automated quantification is desired.
<strong>Name</strong>	<strong>Company</strong>	<strong>Catalog Number</strong>	<strong>Comments</strong>
power food
Agar	Sigma	A7002
Yeast	Bruggeman	–
Yeast extract	MP biomedicals	0210330391
Peptone	Sigma	P6838
Sucrose	Sigma	S9378
Glucose	Sigma	G7021
MgSO4	Sigma	M2643
CaCl2	Merck	1023780500
Methylparabene (CAUTION)	Sigma	H5501
Propionic acid (CAUTION)	Sigma	P1386
Demineralized water	–
Yeast paste	–		yeast grains and water mixture in a 1:1 ratio
Name	Company	Catalog Number	Comments
normal food
Agar	MP biomedicals	215017890
Yeast	bruggeman	–
Corn flour	de Molen	–
Sugar	de Molen	–
Methylparabene (CAUTION)	Sigma	H5501
Propionic acid (CAUTION)	Sigma	P1386
Demineralized water	–