$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Este protocolo é um trecho de Koemans et al., Drosophila Courtship Conditioning As a Measure of Learning and Memory, J. Vis. Exp. (2017).
NOTA: No protocolo descrito abaixo, uma réplica de coleta, treinamento e teste é descrita. Para testar a reprodutibilidade dos resultados, essas etapas devem ser repetidas em paralelo, em vários dias e com grupos separados de moscas (Tabela 1). O protocolo é baseado em um ciclo de vida de 10 dias do ovo ao adulto, o que é normal ao criar moscas em condições constantes de 25 °C, 70% de umidade e um ciclo claro/escuro de 12 horas. Todos os aspectos deste protocolo pressupõem que as condições sejam mantidas constantes durante todo o ensaio. Os horários são indicados como horas antes do acendimento das luzes (BLO) ou após o acendimento das luzes (ALO) na incubadora, pois isso pode ser convenientemente definido dependendo da hora do dia preferida do pesquisador. Utilizar gás CO2 apenas para a colheita inicial de moscas machos virgens e para a colheita de fêmeas pré-acasaladas. Este protocolo de condicionamento de namoro é composto pelas seguintes etapas:
- Estabelecimento de culturas de coleção de fêmeas pré-casadas
- Estabelecimento de culturas para a coleta de cobaias do sexo masculino
- Preparação de blocos habitacionais
- Estabelecimento de frascos de acasalamento para a produção de fêmeas pré-acasaladas padronizadas
- Coleção de cobaias masculinas
- formação
- teste
- Análise de dados e estatísticas de vídeo
1. Estabelecimento de culturas de coleção de fêmeas pré-acasaladas
- Prepare powerfood. Ferva 0,8% (p/v) de ágar, 8% (p/v) de fermento, 2% (p/v) de extrato de levedura, 2% (p/v) de peptona, 3% (p/v) de sacarose, 6% (p/v) de glicose, 0,05% (p/v) de MgSO4 e 0,05% (p/v) de CaCl2 em água por 15 min. Deixe a solução esfriar a 70 ° C antes de adicionar 0,05% (p / v) de metilparabeno (CUIDADO: tóxico) e 0,5% (v / v) de ácido propiônico (CUIDADO: tóxico). Homogeneizar bem, mexendo e arrefecendo até 50 °C, para obter uma solução homogénea.
- Antes que os alimentos solidifiquem à temperatura ambiente, adicione ~ 50 mL de powerfood a cada frasco de plástico de 175 mL. Deixe os alimentos esfriarem ainda mais. Feche o frasco com um plugue.
OBSERVAÇÃO: Powerfood é uma mistura alimentar especializada formulada especificamente para a produção de um grande número de moscas, presumivelmente induzindo a postura de ovos. Powerfood não é usado para produzir moscas machos que serão usadas para análise de comportamento (etapa 2) porque a dieta atípica e a potencial aglomeração podem influenciar o desenvolvimento.
- No dia -11 (Tabela 1), inicie 5-20 culturas selvagens com aproximadamente 60-100 moscas (uma mistura de machos e fêmeas) em frascos de powerfood; estes serão usados na etapa 4 para produzir fêmeas pré-acasaladas padronizadas. Adicione um papel de filtro a cada frasco para aumentar a área sobre a qual as larvas podem pupar; Isso aumentará o número de moscas que podem fechar.
- Repita periodicamente as etapas 1.1-1.3 ao longo do experimento para obter moscas recém-fechadas suficientes como entrada para o "estabelecimento de frascos de acasalamento para a produção de fêmeas pré-acasaladas padronizadas" (etapa 4).
2. Estabelecimento de culturas para a coleta de cobaias do sexo masculino
- Prepare alimentos normais, feitos com 0,5% (p/v) de ágar, 2,75% (p/v) de fermento, 5,2% (p/v) de farinha de milho, 11% (p/v) de açúcar, 0,05% (p/v) de metilparabeno e 0,5% (v/v) de ácido propiônico em água, conforme descrito nas etapas 1.1 e 1.2. Feche os frascos de plástico de 175 mL com um tampão para frascos para moscas.
- No dia -10 (Tabela 1), coloque cerca de 10-20 machos com aproximadamente 30-75 fêmeas virgens (Tabela de Materiais/Equipamentos) em cada frasco de 175 mL contendo alimento normal. Adicione um papel de filtro para aumentar a área de superfície para pupação e maximizar a produtividade.
- Estabelecer de três a seis frascos de 175 mL por genótipo para obter o número necessário de machos sujeitos ao teste.
OBSERVAÇÃO: Mais frascos podem ser necessários, dependendo da produtividade do genótipo desejado.
3. Preparação de blocos habitacionais (Figura 2A)
- Derreta aproximadamente 50 mL de powerfood por bloco de alojamento no micro-ondas ou prepare-o fresco.
- Adicione 500 μL de powerfood a cada poço de um bloco de fundo plano de 96 poços usando uma pipeta multidispensadora.
- Deixe os alimentos solidificarem à temperatura ambiente.
- Cubra os blocos com filme adesivo PCR e use uma agulha para fazer pelo menos 4 furos por poço para fornecer ar fresco às moscas.
- Para poder abrir cada poço, use uma lâmina de barbear para cortar o filme adesivo longitudinalmente entre cada linha. Deixe o filme intacto em uma extremidade do bloco.
- Os blocos podem ser armazenados a 4 °C por até 2 dias.
OBSERVAÇÃO: Deixe os blocos se reequilibrarem à temperatura ambiente antes de usar.
4. Estabelecimento de frascos de acasalamento para a produção de fêmeas pré-acasaladas padronizadas
- No dia -1, remova e descarte todas as moscas selvagens adultas de culturas de coleta de fêmeas pré-acasaladas em 2-5 h BLO.
- Colete moscas usando o aspirador (Figura 2B) desses frascos em intervalos de 2 a 3 h (por exemplo, a 30 min, 2,5 h e 5 h ALO) e coloque-as em um novo frasco para injetáveis powerfood suplementado com uma pequena quantidade de pasta de fermento e papel de filtro.
- Para evitar aglomeração e promover uma atmosfera de acasalamento ideal, não transfira mais de 150-200 moscas para cada novo frasco. Garanta o acasalamento de todas as fêmeas, fornecendo pelo menos 25% de machos. Certifique-se de que fêmeas suficientes estejam presentes nos frascos de acasalamento para acomodar o tamanho do experimento.
OBSERVAÇÃO: Como esta é uma etapa crucial do protocolo, certifique-se de que apenas moscas recém-fechadas e nenhuma mosca, larva ou pupa velha sejam transferidas para o novo frasco de acasalamento.
- Incube esses "frascos de acasalamento" por quatro dias para permitir tempo suficiente para que todas as fêmeas tenham acasalado.
5. Coleção de cobaias masculinas
- No dia 1 (Tabela 1) a 2-3 h BLO, use CO2 para remover todas as moscas adultas dos frascos de coleta machos (etapa 2), mas deixe mais moscas fecharem nas próximas horas.
- Nas próximas 5-6 h, remova as moscas recém-fechadas a cada 20-30 min usando CO2 e coloque cada macho em um poço individual do bloco de alojamento (etapa 3) usando o aspirador (Figura 2B).
- Sele novamente o poço com o filme de PCR adesivo.
OBSERVAÇÃO: Este é um passo crucial no protocolo. Os machos devem ser coletados com frequência. Os machos coletados devem ser isolados no bloco habitacional próximo ao momento da eclosão, quando apresentam pigmentação pálida e presença de mecônio no abdome translúcido.
OBSERVAÇÃO: O uso suave do aspirador permite a transferência de moscas; no entanto, o uso inadequado estressará as moscas, causando variação no ensaio (consulte a Discussão).
- Procure coletar até 48 machos por genótipo. Isso fornece um pequeno excesso ao número máximo de machos necessários para a análise de condições ingênuas e treinadas, permitindo alguma perda durante as etapas posteriores da transferência.
6. Treinamento
- Remover as moscas do frasco para injetáveis de acasalamento (passo 4.2) utilizando CO2 e separar as fêmeas pré-acasaladas dos machos.
- Usando o aspirador, adicione uma única fêmea anestesiada e pré-acasalada a cada poço em uma fileira de um novo bloco de alojamento.
- Usando o aspirador e sem anestesia, transfira um macho ingênuo individual do bloco de alojamento configurado na etapa 5.2 para o poço contendo uma fêmea pré-acasalada. Depois que o macho for colocado no poço, feche imediatamente com o filme adesivo; Não permita que o macho escape.
OBSERVAÇÃO: Transfira moscas machos do aspirador para o bloco habitacional, aproveitando seu comportamento natural de "geotaxia negativa".
- Repita as etapas 6.2-6.3 até que pares masculinos e femininos suficientes sejam estabelecidos. Idealmente, estabeleça 24 pares, duas fileiras completas de um bloco habitacional, por genótipo. Deixe os homens ingênuos restantes no bloco habitacional original configurado na etapa 5.2.
- Deixe os pares macho-fêmea intactos durante o período de treinamento (Tabela 2, Figura 1B).
OBSERVAÇÃO: Durante esse tempo, o macho cortejará e será rejeitado pela fêmea pré-acasalada. Para aprendizagem e STM, o período de treinamento é de 1 h e para LTM, o período de treinamento é de 7 a 9 h.
- Termine o treinamento (Tabela 2, Figura 1B) usando um aspirador para separar suavemente o macho da fêmea pré-acasalada; não use anestesia. Coloque o macho separado em um novo bloco habitacional.
- Use o aspirador para transferir todos os homens virgens suavemente e sem anestesia do bloco de alojamento configurado na etapa 5.2 para um novo bloco de alojamento.
OBSERVAÇÃO: Esta etapa é opcional para STM e aprendizado, mas é muito importante para LTM porque as moscas são alojadas por mais 24 horas para testar o LTM.
- Para STM e LTM, deixe os machos descansarem por 1 h e ~ 24 h, respectivamente (Tabela 2, Figura 1B) antes do teste (etapa 7).
- Para aprender, teste imediatamente os homens treinados e ingênuos (etapa 7).
7. Teste
- Recolha as moscas dos frascos de acasalamento (passo 4.2) utilizando CO2 e separe as fêmeas pré-acasaladas dos machos.
- Deixe as fêmeas se recuperarem da anestesia por pelo menos 1 h em um frasco contendo comida normal.
- Monte os gravadores de vídeo com antecedência (Figura 2C), para ter todo o equipamento pronto antes do início do teste.
- Inicie o teste de acordo com os diferentes cronogramas de aprendizado, STM e LTM (Tabela 2, Figura 1B). Realize o teste imediatamente após o treinamento para aprendizado, 1 h após o treinamento para STM e 24 h após o treinamento para LTM.
- Usando o aspirador, transfira suavemente um macho individual do bloco de alojamento em repouso ou do bloco de alojamento de treinamento se o aprendizado estiver sendo testado (passo 6.7, treinado; passo 6.8, ingênuo) para metade de uma arena de namoro com a divisória fechada (Figura 2D; consulte o Arquivo S1 para um plano de construção).
OBSERVAÇÃO: O uso do comportamento natural de "geotaxia negativa" deve ser suficiente para transferir as moscas machos do aspirador para a arena de namoro.
- Mova rapidamente, mas com cuidado, o orifício de entrada para a próxima arena e repita a etapa 7.5 até que todas as 18 arenas contenham um macho.
- Usando o aspirador e sem CO2, adicione uma fêmea pré-acasalada (coletada na etapa 7.2) à outra metade de todas as 18 arenas.
- Coloque cuidadosamente a câmara de corte sob a câmera, com a abertura dos poços voltada para baixo (Figura 2C).
- Remova a divisória das arenas para permitir a interação direta entre os machos e as fêmeas pré-acasaladas.
- Comece imediatamente a gravar o comportamento por pelo menos 10 min.
OBSERVAÇÃO: Ao usar uma configuração de duas câmeras, a gravação paralela de duas placas de namoro pode ser feita em intervalos de tempo sobrepostos para maximizar a eficiência.
- Esvazie as arenas de namoro usando um aspirador de pó portátil e deixe a câmara de namoro ventilar antes de reutilizá-la.
- Repita as etapas 7.4-7.11 até que o teste de todos os genótipos e condições (ou seja, ingênuos e treinados) tenha sido concluído.
8. Análise de dados de vídeo e estatística
- Calcule o índice de namoro (IC), definido como a porcentagem de tempo que os machos cortejam durante os primeiros 10 minutos do período de teste, para cada mosca macho.
OBSERVAÇÃO: Isso pode ser feito manualmente, observando o comportamento estereotipado do namoro (Figura 1A) ou usando um software de computador para quantificação automatizada do comportamento do namoro.
OBSERVAÇÃO: Recomenda-se analisar 40-60 homens por condição ao longo de três dias para obter poder estatístico suficiente e julgar a consistência dos dados do IC.
- Calcule o índice de aprendizagem (LI), definido como a redução percentual no IC médio de homens treinados em comparação com homens virgens (LI = (ICingênuo – ICtreinado) / ICingênuo). Avalie o LI para cada dia de teste e compare-o com o LI cumulativo calculado a partir de todos os dias de teste combinados.
- Faça um arquivo de dados de tabulação de duas colunas separado com "Genótipo" e "CI" como cabeçalhos.
OBSERVAÇÃO: Esses títulos diferenciam maiúsculas de minúsculas. O nome do genótipo para cada IC deve consistir em uma descrição do genótipo seguida por um sublinhado e a condição de treinamento (por exemplo, genotype_N e genotype_LTM, etc., onde N = ingênuo e LTM = memória de longo prazo; consulte o Arquivo Suplementar S2 para obter um exemplo). Essa anotação é essencial, pois a função analearn identificará moscas treinadas e ingênuas com base nos caracteres presentes após o primeiro sublinhado na coluna "Genótipo".
- Use o script analearn R (Arquivo Suplementar S3) para realizar um teste de randomização para julgar a significância estatística das diferenças entre os valores de LI de diferentes genótipos.
- Origine o script (Arquivo Suplementar S3) em R, que define uma função chamada "analearn."
OBSERVAÇÃO: A definição da função é: analearn <- function(nboot = 10.000, naivelevel = 'N', refmutation = NA, datname = NA, header = TRUE, seed = NA, writeoutput = TRUE).
- Inicie a função inserindo "analearn()" na linha de comando do R e selecionando o arquivo de dados a ser analisado (produzido na etapa 8.3) por meio da janela pop-up.
- Escolha a mutação de referência, que é o genótipo controle, digitando o número correspondente e pressionando enter.
OBSERVAÇÃO: Depois de selecionar o genótipo de referência, o script leva vários segundos para executar 10.000 réplicas de bootstrap.
- Observe a tabela de saída (Tabela 3), que contém o genótipo, a condição de aprendizagem (ou seja, aprendizagem, STM ou LTM), o IC médio virgen, o IC médio treinado, o LI, a diferença entre o LI do controle em comparação com a condição experimental (LI dif), o limite inferior (LL) e o limite superior (UL) do intervalo de confiança de 95% do LI dif, e o valor de p indicando a probabilidade de não haver diferença significativa.
NOTA: analearn armazenará um arquivo de texto de saída no diretório onde o arquivo de dados está localizado. No entanto, a tabela de saída também aparece no console do R-Studio. O nome padrão é construído com base no nome do arquivo de dados fornecido.
- Existem vários argumentos na função analearn que podem ser usados para alterar as configurações padrão da função para ajustar os parâmetros do bootstrapping.
NOTA: "nboot" define o número de réplicas de bootstrap e é definido como 10.000 por padrão. Esse valor pode ser alterado para qualquer número inteiro maior que zero. A Tabela 5 lista vários argumentos que podem ser usados para alterar as configurações padrão da função. No entanto, não é recomendável usar dados produzidos com um número baixo de réplicas de bootstrap.
