Este protocolo é um trecho de Zhao et al, Eletrocardiografia de superfície in vivo para peixe-zebra adulto, J. Vis. Exp.(2019).
Todos os experimentos deste estudo foram conduzidos de acordo com o Guia dos Institutos Nacionais de Saúde dos EUA para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório. Todos os protocolos de animais neste estudo foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da UCLA.
1. Indução anestésica
- Prepare anestesia de imersão para controle da dor e imobilização de peixes para evitar artefatos de movimento durante a aquisição de dados de ECG. A maioria dos laboratórios usa tricaína de imersão (etil 3-aminobenzoato de metanossulfonato, MS-222).
- Para fazer a solução estoque de tricaína a 0,4%, combine os seguintes itens em um frasco de vidro escuro com tampa de rosca: 400 mg de pó de tricaína, 98 mL de água bidestilada e 2 mL de Tris 1 M (pH 9). Ajuste para pH 7,0 usando 1 N NaOH ou 1 N HCl conforme necessário.
- Para fazer a solução final de imersão em tricaína, determine a concentração mínima apropriada para a idade, tamanho, estado metabólico, cepa, modelo da doença, objetivos científicos e duração do procedimento do peixe-zebra.
- Realize um estudo de concentração-resposta de tricaína, titulando para cima ou para baixo a partir da concentração recomendada de 168 mg/L (ou 0,0168%)9se necessário, para atingir o nível 4 de anestesia dentro de 3 min com o menor número possível de toxicidades cardiorrespiratórias. Por exemplo, neste estudo, a imersão de peixe-zebra AB do tipo selvagem de 12 a 18 meses de idade em uma solução de tricaína a 0,02-0,04% induzirá o nível 4 da anestesia em 3 min.
OBSERVAÇÃO: No nível 4 da anestesia, o equilíbrio e o tônus muscular são completamente perdidos e a taxa de movimento opercular é reduzida.
- Se necessário, consulte o veterinário no Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) para obter orientações adicionais sobre a adequação da seleção do(s) anestésico(s) e via de administração.
- Mergulhe um peixe-zebra adulto em um prato contendo solução de tricaína da concentração mais baixa predeterminada e aprovada pela IACUC (por exemplo, 0,02-0,04% neste estudo) para induzir o nível 4 de anestesia em 3 minutos (Figura 1).
- Para o protocolo de ECG de sobrevivência, mantenha a sessão de gravação de ECG o mais breve possível (menos de 10 min). Para breves sessões de gravação de ECG com duração inferior a 15 min, a manutenção da anestesia não é necessária.
- Para longas sessões de gravação de ECG com duração de horas, use um sistema de perfusão intramuscular de ação prolongada e um sistema de perfusão oral para fornecer ampla hidratação e oxigenação.
2. Colocação de eletrodos de ECG
- Uma vez que o peixe-zebra mantenha o nível 4 de anestesia por 3 s, use um par de pinças rombas para transferir o peixe imediatamente para a fenda de esponja úmida com sua superfície ventral voltada para cima para a colocação de eletrodos de eletrodo de ECG (Figura 2).
- Insira suavemente os três eletrodos de derivação do ECG na musculatura do peixe a aproximadamente 1 mm de profundidade para estabelecer uma derivação bipolar no plano frontal paralela à orientação cranial caudal esquerda e direita do eixo principal cardíaco.
- Posicione o eletrodo positivo (vermelho) na linha média ventral ao nível do bulbo arterial, ou seja, 1-2 mm acima de uma linha imaginária que conecta as duas bordas inferiores dos opérculos (Figura 2A).
- Posicione o eletrodo negativo (preto) caudalmente e 0,5-1,0 mm lateralmente à esquerda em relação ao eletrodo positivo, a uma distância maior que o comprimento apicobasal máximo do ventrículo adulto do peixe-zebra adulto (Figura 2A).
- Posicione o eletrodo de referência (verde) caudalmente, próximo à região anal.
OBSERVAÇÃO: Como o eixo principal cardíaco varia um pouco de peixe para peixe, para maximizar as amplitudes das ondas R e T, ajuste as posições das derivações fazendo apenas pequenas mudanças sistemáticas por tentativa e erro. Por exemplo, troque um eletrodo (positivo ou negativo), em vez de ambos os eletrodos, de cada vez e faça mudanças graduais em uma direção especificada antes de mudar para outra direção, em vez de fazer alterações erráticas em direções aleatórias.
3. Gravação de ECG
- Abra o programa de aquisição de dados de ECG. Selecione uma configuração desejada nos menus suspensos para alcance, passa-baixa e passa-alta. Por exemplo, a seguinte configuração no sistema de gravação de ECG in vivo usado neste experimento produz uma relação sinal-ruído consistente e satisfatória para um peixe-zebra adulto normal: faixa "2 mV", passa-baixa "120 Hz" e passa-alta "0,03 s".
- Pressione Iniciar para iniciar a gravação contínua de ECG sem lacunas a uma taxa de amostragem de 1 kHz.
- Para otimizar o posicionamento do eletrodo para uma relação sinal-ruído máxima, pressione Parar para interromper a gravação do ECG e review o traçado do ECG logo após a primeira tentativa de gravação para cada coração. Para diagnosticar que um ECG de peixe-zebra adulto é normal, confirme se todos os quatro critérios de validação a seguir são atendidos (Figura 3):
- Critério 1: Garantir que todas as formas de onda de ECG (P, QRS e T) sejam distintas e facilmente visíveis.
- Critério 2: Certifique-se de que a onda P seja positiva.
- Critério 3: Garantir que o complexo QRS líquido é positivo (ou seja, a amplitude da onda R é maior do que a soma das amplitudes das ondas Q e S).
- Critério 4: Certifique-se de que a onda T seja positiva.
- Se for esperado um ECG normal, reposicione os eletrodos (tente primeiro o eletrodo negativo), se necessário, até que todos os quatro critérios de validação sejam satisfeitos.
- Se uma onda T normal for esperada, mas a onda T for muito pequena, reposicione os eletrodos para maximizar a amplitude da onda T.
- Retome a gravação do ECG após otimizar o posicionamento do eletrodo. Salve as varreduras de ECG para análise subsequente.
4. Recuperação da anestesia
- No final da sessão de gravação de ECG, remova cuidadosamente os eletrodos sem ferir o peixe. Transfira o peixe para água fresca e oxigenada, livre de tricaína.
- Para facilitar a recuperação da anestesia, esguiche água sobre as brânquias vigorosamente com uma pipeta Pasteur até que o peixe retome o movimento regular das guelras ou a natação.
- Monitore o peixe para recuperação total da anestesia (normalmente 1-2 min), conforme indicado pela capacidade do peixe de nadar ereto por pelo menos 5 s.
