Produção de transgênicos Xenopus laevis Por Restrição Integração Mediada por Enzima e Transplante Nuclear

Resumo

Este protocolo de vídeo demonstra um método para a geração de transgênicos Xenopus laevis Por introdução de transgenes em núcleos do esperma seguida de transplante nuclear em ovos não fertilizados.

Resumo

Integração estável dos produtos gene clonado no genoma Xenopus é necessário para controlar o tempo e lugar de expressão, para expressar genes em fases posteriores do desenvolvimento embrionário, e para definir como potenciadores e promotores de regular a expressão de genes no interior do embrião. O protocolo demonstrado aqui pode ser usado para produzir de forma eficiente embriões transgênicos Xenopus laevis. Esta abordagem transgenia envolve três partes: 1. Núcleos espermáticos são isolados do adulto X. testículo laevis pelo tratamento com lysolecithin, que permeabilizes da membrana plasmática de espermatozóides. 2. Extrato de ovo é preparado por centrifugação de baixa velocidade, além de cálcio para causar o extrato para avançar para a interfase do ciclo celular, e uma centrifugação de alta velocidade para isolar citosol interfase. 3. Nuclear transplante: os núcleos e extrato são combinados com o DNA do plasmídeo linearizado para ser apresentado como o transgene e uma pequena quantidade da enzima de restrição. Durante uma reação de curto, extrato de ovo parcialmente decondenses a cromatina de espermatozóides ea enzima de restrição gera quebras cromossômicas que promovem a recombinação do transgene no genoma. Os núcleos de espermatozóides tratados são então transplantados para ovos não fertilizados. Integração do transgene geralmente ocorre antes da primeira clivagem embrionária de tal forma que os embriões resultantes não são quiméricos. Esses embriões podem ser analisados ​​sem qualquer necessidade de raça para a próxima geração, permitindo a geração eficiente e rápida de embriões transgênicos para análises de promotor e função do gene. Adulto X. laevis resultante deste procedimento também propagar o transgene através da linha germinativa e pode ser usado para gerar linhas de animais transgénicos para fins múltiplos.

Protocolo

Versões modificadas deste abordagem transgênese foram inicialmente descritas em ¹ e ^2.

A. preparação núcleos do esperma

Este método de preparação núcleos é adaptado de Murray ^3, mas os inibidores da protease foram omitidos como elas interferem com o desenvolvimento subseqüente de ovos transplantado com núcleos de esperma. Alíquotas são congeladas a -80 ° C e podem ser usados ​​para transplantes por aproximadamente 6 meses.

Todas as soluções devem ser preparadas e colocadas no gelo antes de começar a preparação.

1. Anestesiar 1-2 adultos do s....

Discussão

Para cada construção de transgênicos a serem testados, geralmente transplante de núcleos em 500-1000 ovos; nessa escala, podemos gerar embriões transgênicos expressando até 10 construções diferentes por dia, dependendo de quantas mulheres são induzidas a pôr ovos. Desses transplantes, cerca de um terço do cleave ovos e 60-80% destes embriões cleaving proceder através gastrulação normalmente. Dependendo das condições de reação utilizadas, entre 10-50% desses embriões expressar o transgene de interesse. Portanto, uma vez .......

Materiais

A. preparação núcleos do esperma

Reagentes:

1. 1X MMR (2mM CaCl _2, HEPES 5mM, pH 7,5, 2mM KCl, 1 mM MgCl _2, 100mM NaCl).
2. 0,1% tricaina metanosulfanato (MS222, ácido aminobenzóico etil éster, Sigma A-5040), bicarbonato de sódio a 0,1%. Dissolvem na água.
3. Manteiga Preparação 2X Nuclear (NPB). No dia da preparação núcleos espermáticos, compõem 30 ml de NPB 2X de alíquotas das soluções estoque armazenado congelado: 500 mM de sacarose (1,5 M de ações), 30 mM HEPES (stock 1M; titular com KOH para que pH 7,7 é de 15 mM), 1 trihydrochloride espermidina mM (Sigma S-2501, 10 ações mM), 0,4 mM tetrahidrocloreto espermina (Sigma S-1141, 10 ações mM), 2 mM ditiotreitol (Sigma D-0632, 100 ações mM), 2 mM EDTA (500 mM EDTA, pH 8,0).
4. Use o 2XNPB para fazer a. 30ml 1X NPB, b. 10ml 1XNPB +3% BSA (fração V, Sigma A-7906), c. BSA 1XNPB 5ml 0,3%.
5. Lysolecithin: 100 l de 10 mg / ml L-α-LYSO-lecitina, gema de ovo (Calbiochem, 440154); dissolver à temperatura ambiente imediatamente antes da utilização. Loja de ações sólida a 20 ° C. Descartar o pó de ações se torna-se pegajosa.
6. Albumina sérica bovina (BSA), 10% (w / v) BSA (fração V, Sigma A-7906) Maquiagem 5 ml na água no dia da preparação núcleos do esperma.
7. Esperma de armazenamento de buffer (1 ml) 1X NPB, glicerol 30%, BSA 0,3%.
8. Tampão de diluição do esperma: 250 mM de sacarose, 75 mM KCl, 0,5 mM trihydrochloride espermidina, espermina tetrahidrocloreto 0,2 mM. Titular de pH 7,3-7,5 e 0,5-1 loja alíquotas ml a 20 ° C.
9. Hoechst No. 33342 (Sigma B-2261): 10 ações mg / ml em dH ₂ O, armazenar em um recipiente apertado luz a 20 ° C.

Equipamento:

• Rotor de caçamba móvel e centrifugar
• gaze
• instrumentos de dissecação (pinças e tesouras)
• microscópio de fluorescência
• funil
• luvas
• hemocitômetro
• agulhas (26 gauge)
• toalhas de papel
• placas de Petri (60 mm)
• pipetas
• plástico (5 e 10 ml)
• Pipetman dicas (1 ml e 200μl)
• Seringas (1 ml)
• tubos (14 ml; Falcon, 2059)
• tubos
• microcentrífuga (1,5 ml)

B. Elaboração de Extrato de Alta Velocidade

Reagentes:

1. Modificado 1X Marc da campainha (MMR): 100 mM NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgCl _{2, 2} mM CaCl _2, 5 mM HEPES, pH 7.5. Prepare um estoque de 10X, e ajustar o pH com NaOH para 7,5.
2. 20X tampão Extract (XB) estoque de sal: 2 M KCl, 20 mM MgCl _{2, 2} mM CaCl _2, filtram-esterilizar e armazenar a 4 ° C.
3. Extrato de buffer (XB; recém-preparados e armazenados em gelo): 1X sais XB, 50 mM de sacarose, HEPES 10 mM (1 M de ações, titulada com KOH de modo que o pH é de 7,7 quando diluído a 15 mM; filtro de esterilizar e armazenar em alíquotas a 20 ° C). Prepare cerca de 100 ml.
4. 2% (w / v) L-Cisteína cloridrato de 1-hidrato: Formada em 1X sais XB antes de usar e titulada até pH 7,8 com NaOH. Prepare cerca de 300 ml.
5. CSF-XB: 1X sais XB, 1 mM MgCl ₂ (além de MgCl ₂ apresentam em sais XB; concentração final 2 mM), 10 mM HEPES, pH 7,7, 50 mM de sacarose, 5 mM EGTA, pH 7.7. Prepare 50 ml.
6. Inibidores da protease: Mistura de leupeptin, chymostatin e pepstatin, cada dissolvido para uma concentração final de 10 mg / ml em dimetil sulfóxido (DMSO). Loja em pequenas alíquotas a 20 ° C.
7. 1 M CaCl _2.
8. Cabaz energético: 150 fosfato de creatina mM, 20 mM ATP, 20 mM MgCl _2.
9. Pregnant Mare Serum Gonadotropin (PMSG): 100 U / ml PMSG (PG600 ®, Intervet, Inc., 021.825). Dissolver em água e armazenadas a 20 ° C.
10. Gonadotrofina Coriônica Humana (HCG): 1000 U / ml HCG (CHORULON ®, Intervet, Inc., 057.176). Dissolver em água e armazenadas a 4 ° C.

Equipamento:

• Xenopus laevis fêmeas
• Agulhas (18 e 26 gauge)
• Pipeta Pasteur
• ampla furo
• Seringas (1 mL)
• Tubos de microcentrífuga (0,5 mL)
• Tubos, espessura de parede de policarbonato (Beckman, 349622)
• Tubos, UltraClear (14 x 95 mm; Beckman, 344060)
• Ultracentrífuga e rotores (por exemplo, Beckman TL-100 com rotores SW 40 Ti e TLA-100,3)
• Copos para coleta de ovos
• Baldes ou recipientes para a realização de rãs do sexo feminino (por exemplo, 4-L copos de plástico com tampa mesh).

C. Nuclear transplante.

Reagentes:

1. Agarose 2,5% em 0.1XMMR (para fazer pratos de injeção)
2. Cisteína 2,5% em 1XMMR, PH8.0, preparado no dia de uso
3. Ficoll
4. 10 mg / ml de gentamicina (estoque 1000X)
5. extrato de ovos de alta velocidade (veja acima)
6. 100 MgCl ₂
7. MMR 10X (veja acima)
8. Enzima de restrição (por exemplo, NotI de New England Biolabs)
9. Tampão de diluição do esperma (SDB; veja acima) e núcleos de espermatozóides (veja acima)
10. Gonadotrofina Coriônica Humana (HCG) como acima
11. óleo mineral (Sigma, M8410)
12. Plasmídeo linearizado para ser apresentado como o transgene: Prepare plasmídeo linearizado em uma concentração de cerca de 100 ng / mL em estéril, livre de nuclease água (evitamos Tris EDTA e contendo buffers, que são pouco tóxicos para os embriões). A enzima de restrição usado para linearizar o plasmídeo não tem que ser o mesmo que o utilizado na reação de transferência nuclear. Nós usamos geralmente NotI para todas as reações, independentemente do que é plasmídeo linearizado com. Alguns calibração da diluição enzima usada na reação pode ser necessário, como enzimas em excesso pode causar efeitos adversos sobre a pós-gástrula desenvolvimento. Plasmídeo pode ser purificado de várias maneiras diferentes: costumamos usar o kit de purificação QIAquick Qiagen PCR de acordo com as instruções do fabricante; purificação de uma única faixa de um gel não é necessário. Se plasmídeo é purificado usando fenol / clorofórmio e precipitação extrações de etanol, a certeza de remover todos os vestígios de orgânicos e etanol.

Equipamento:

Pratos de agarose injectável: Em uma placa de Petri 60 milímetros de plástico, colocar uma pequena 35mmX35mm pesar de barco no fundido agarose 2,5% em 0.1XMMR água para criar uma depressão com um fundo revestido agarose para o preenchimento com os ovos. Uma vez agarose endureceu wrap, em parafilme e armazenar a 4 ° C até o uso. Faça 2-3 pratos com antecedência para cada reação transgênico você pretende fazer.

Bomba de infusão: Nós usamos uma bomba de infusão única seringa do Aparelho Harvard, equipado com uma seringa de 3 cc / agulha cheia de óleo mineral (Sigma M-8410). Blunt a ponta da agulha da seringa (para mantê-lo de perfurar a tubulação) e conectar o tubo tygon bem. Funcionar a bomba em ~ 10nl/sec; isso pressupõe que o tempo a agulha é em cada ovo haverá seg maior que 1. Bomba deve ser pré-run por vários minutos antes de transgênese de partida para o dia para garantir que o êmbolo da seringa para fique nivelada com o pistão e esse fluxo constante positiva de óleo para fora do tubo está ocorrendo.

Agulhas para a transferência nuclear. Utilizando um extrator de micropipeta, gerar agulhas com comprimento, dicas inclinada. Clipe estes com um fórceps sob um microscópio de dissecação equipado com um micrômetro ocular para obter uma abertura ~ micron 80 com uma forma chanfrada.

Outros equipamentos: Xenopus laevis fêmeas, estereomicroscópio, incubadora, micromanipulador, puxador de microinjeção agulha (por exemplo, modelo P-87, Sutter), agulhas de seringa (26 gauge), agulhas microinjeção de vidro, micrômetro ocular calibrada para recorte de dicas microinjeção agulha de diâmetro 80μm, placas de Petri, pesar barcos 35mm, tubos de Tygon (ID = 1 / 32 pol, OD = 3 / 32 pol)