$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Este protocolo é um trecho de Koyle et al., Criando a mosca-da-fruta Drosophila melanogaster sob condições axênicas e gnotobióticas, J. Vis. Exp. (2016).
1. Ovos descorionados e transferência para dieta estéril
- Prepare o gabinete de biossegurança pulverizando o interior (incluindo as laterais) com etanol 70%. Limpe o fundo com um lenço de papel e esterilize o capuz com luz ultravioleta por ~ 15 min. Esterilize todos os suprimentos não biológicos (copos de amostra, pincel, pinça, recipiente de lixo, 400 ml de água esterilizada e 100 ml de hipoclorito de sódio a 0,6%) pulverizando com etanol e colocando imediatamente no gabinete de biossegurança. Esterilize com luz UV por 15 min.
- Comece a primeira das 2 lavagens com hipoclorito de sódio colocando a bucha com os ovos em um copo de amostra de 120 ml ou outro recipiente estéril. Despeje lentamente ~ 90 ml de solução de hipoclorito de sódio a 0.6% na bucha até um pouco abaixo da borda.
- Enxágue os ovos por 2,5 min. Ressuspenda periodicamente os ovos usando uma pinça para mover a bucha para cima e para baixo na solução de hipoclorito.
- Transfira a bucha diretamente para um segundo copo de amostra, pré-preenchido com 90 ml de alvejante, dentro do gabinete de biossegurança.
- Repita a etapa 1.3 dentro do gabinete de biossegurança. No final do segundo tratamento com alvejante, os ovos devem começar a aderir às laterais da bucha.
- Execute as etapas 1.7-1.8 no gabinete de biossegurança.
- Descarte o alvejante e lave a bucha com água estéril 3 vezes. Ressuspenda os ovos várias vezes durante cada lavagem, movendo a bucha com uma pinça. No final da terceira lavagem, a maioria dos ovos deve ser presa na lateral da bucha.
- Usando um pincel esterilizado em etanol, transfira os ovos da lateral da bucha para a dieta estéril. Transfira os ovos individualmente ou em pequenos lotes. Apontar para 30-50 ovos por frasco. Deixe as tampas soltas para permitir que o oxigênio entre no tubo. Se os frascos para injetáveis devem permanecer axênicos, transfira para uma incubadora de insetos; caso contrário, adicione bactérias como abaixo.
2. Faça moscas gnotobióticas usando 4 espécies bacterianas
- Prepare bactérias
- Prepare uma cabine de biossegurança esterilizada com os suprimentos necessários (pipetas, caixas de ponteiras de pipeta, tubos de centrífuga esterilizados, caldo MRS e racks de tubos de ensaio) como na etapa 1.1. Limpe a parte externa dos tubos de ensaio com um lenço de laboratório embebido em etanol antes de colocá-los no gabinete de biossegurança.
- Pulverize as bactérias transferindo primeiro 500 μl de crescimento noturno para um tubo de microcentrífuga estéril. Se a densidade bacteriana for baixa, adicione até 1,5 ml a cada tubo ou remova sequencialmente o sobrenadante e adicione cultura extra ao mesmo tubo. Remova as amostras do gabinete de biossegurança e centrifugue por 10 min a 10.000 x g. Use pontas de filtro para evitar contaminação entre amostras.
- Determine a densidade de cada cultura medindo OD600. Se estiver usando um leitor de placas de vários poços, transfira 200 μl de cada cultura para uma placa de 96 poços em diluições de 1, 2 e 4 vezes.
- Determinar a quantidade de mMRS a diluir cada sedimento celular (2.1.2) utilizando um espectrofotómetro de leitura de placas e as seguintes equações. Planeje adicionar caldo suficiente para inocular 50 μl em cada frasco para moscas.
- Colete leituras OD600 para uma diluição 1:1, 1:2 e 1:4 de cada cultura bacteriana em um espectrofotômetro de leitura de placas. Seleccionar a diluição para cada estirpe bacteriana que produza um valor OD600 entre 0,1 e 0,2 e utilizar este valor e o factor de diluição correspondente como «O» e «D» nas fórmulas indicadas nos pontos 2.1.4.2 ou 2.1.4.3.
- Se estiver usando as 4 espécies descritas aqui, normalize as células para densidades equivalentes de unidade formadora de colônias (UFC) / ml (conversão de OD600 para UFC determinada anteriormente em Newell e Douglas, Appl Environ Microbiol. (2014)) usando esta equação:
E = ((O-B) x V x D)/C
em que E = volume a ressuspender em pellets (μl), O = OD600 bactérias, B = OD600 meios em branco, D = diluição em dobras, V = μl de cultura bacteriana antes da centrifugação, C = OD600 de constante predeterminada. Consulte Arquivo de código suplementar para obter exemplos de cálculos usando essas equações. Para espectrofotômetros que ficam em branco automaticamente, use "O" no lugar de "O-B".
OBSERVAÇÃO: As constantes predeterminadas (unidades OD600, normalizadas para 107 UFC ml-1, constantes derivadas em Newell e Douglas, Appl Environ Microbiol. (2014)) são os seguintes: A. tropicalis (0,052), A. pomorum (0,038), L. brevis (0,056), L. plantarum (0,077).
- Se estiver usando outras espécies bacterianas (nenhuma constante UFC/OD600 está disponível), normalize a densidade para OD600 = 0,1 usando esta equação:
E = ((O-B) x V x D)/0,1 OD600
OBSERVAÇÃO: As unidades são as mesmas da etapa 2.1.4.2. Consulte Arquivo de código suplementar para obter exemplos de cálculos usando essas equações.
- Na cabine de biossegurança, remova o sobrenadante com uma ponta de pipeta e ressuspenda o pellet em mMRS ou PBS fresco, conforme calculado na etapa 2.1.4.2.
- Inocular bactérias
- Transferir 50 μl da bactéria para os tubos cônicos com dieta estéril e ovos descorionados em gabinete de biossegurança. Adicione bactérias após a transferência do ovo para evitar a contaminação entre os frascos.
- Colocar os tubos inoculados numa incubadora a 25 °C.
3. Medir a carga/teste de esterilidade da UFC
- Para medir a carga de UFC em homogeneizados de moscas de corpo inteiro, transfira 5 moscas (5-7 dias após a eclosão) para um tubo de microcentrífuga de 1,7 ml contendo 125 μl de grânulos de cerâmica e 125 μl de caldo mMRS. Homogeneizar moscas usando um homogeneizador de tecidos por 30 segundos a 4,0 M/seg.
- Alternativamente, omita as esferas e homogeneize manualmente em tubos de microcentrífuga com pilões de plástico por 1 min.
- Se quantificar a microbiota intestinal, esterilize as moscas para remover micróbios exógenos. Transfira as moscas para um tubo de microcentrífuga contendo 100 μl de etanol a 70% por 1 min, aspire o etanol e transfira para um novo tubo de microcentrífuga para homogeneizações. Se o conteúdo de DNA do intestino for medido, enxágue por 1 min com hipoclorito de sódio a 0,6% antes da lavagem com etanol.
- Diluir o homogeneizado com 875 μl de mMRS, vórtice durante 5 segundos e pipetar 120 μl de homogenato no primeiro alvéolo de uma placa de microtitulação.
- Efectuar duas diluições sequenciais 1:8 utilizando 10 μl de homogenato e 70 μl de MRS nos dois alvéolos seguintes.
- Retirar 10 μl do primeiro alvéolo e adicioná-lo ao segundo alvéolo contendo 70 μl de MRS. Misturar bem o conteúdo do segundo alvéolo, transferir 10 μl do segundo alvéolo para o terceiro alvéolo contendo 70 μl de MRS e homogeneizar. Isso leva a 3 concentrações totais do homogeneizado original de 1.000 μl: não diluído, 1:8 e 1:64.
- Transferir 10 μl de cada diluição para uma placa de EMRm (utilizando uma pipeta multicanal, se desejado). Incline ligeiramente o prato para espalhar a diluição vários milímetros pela superfície do ágar e deixe o líquido secar antes de mover a placa. O líquido seca rapidamente na placa se as placas tiverem 2 dias, reduzindo a mistura de duas gotículas vizinhas.
- Incubar a 30 °C durante 1-2 dias. Remova as placas da incubadora uma vez distintas, as colônias individuais são visíveis e conte a partir de uma diluição com 10-100 colônias isoladas.
- Calcule a UFC por mosca usando a equação E = C x D/P x V/F, onde E = UFC por mosca, C = número de colônias contadas, D = diluição, P = μl plaqueado, V = volume de mosca homogeneizada e F = número de moscas homogeneizadas.