É necessária uma assinatura da JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou comece sua avaliação gratuita.

Abstract

Fonte: Koyle, M. L., et al. Criando a mosca-da-fruta e Drosophila melanogaster sob condições axênicas e gnotobióticas. J. Vis. Exp. (2016).

A microbiota de Drosophila afeta o desenvolvimento, a imunidade e a fisiologia do animal. Este vídeo descreve um método para quantificar bactérias de moscas, determinando as unidades formadoras de colônias de preparações de corpo inteiro. O protocolo apresentado demonstra a técnica com moscas, criadas em condições gnotobióticas usando quatro espécies bacterianas.

Protocol

Este protocolo é um trecho de Koyle et al., Criando a mosca-da-fruta Drosophila melanogaster sob condições axênicas e gnotobióticas, J. Vis. Exp. (2016).

1. Ovos descorionados e transferência para dieta estéril

1. Prepare o gabinete de biossegurança pulverizando o interior (incluindo as laterais) com etanol 70%. Limpe o fundo com um lenço de papel e esterilize o capuz com luz ultravioleta por ~ 15 min. Esterilize todos os suprimentos não biológicos (copos de amostra, pincel, pinça, recipiente de lixo, 400 ml de água esterilizada e 100 ml de hipoclorito de sódio a 0,6%) pulverizando com etanol e colocando imediatamente no gabinete de biossegurança. Esterilize com luz UV por 15 min.
2. Comece a primeira das 2 lavagens com hipoclorito de sódio colocando a bucha com os ovos em um copo de amostra de 120 ml ou outro recipiente estéril. Despeje lentamente ~ 90 ml de solução de hipoclorito de sódio a 0.6% na bucha até um pouco abaixo da borda.
3. Enxágue os ovos por 2,5 min. Ressuspenda periodicamente os ovos usando uma pinça para mover a bucha para cima e para baixo na solução de hipoclorito.
4. Transfira a bucha diretamente para um segundo copo de amostra, pré-preenchido com 90 ml de alvejante, dentro do gabinete de biossegurança.
5. Repita a etapa 1.3 dentro do gabinete de biossegurança. No final do segundo tratamento com alvejante, os ovos devem começar a aderir às laterais da bucha.
6. Execute as etapas 1.7-1.8 no gabinete de biossegurança.
7. Descarte o alvejante e lave a bucha com água estéril 3 vezes. Ressuspenda os ovos várias vezes durante cada lavagem, movendo a bucha com uma pinça. No final da terceira lavagem, a maioria dos ovos deve ser presa na lateral da bucha.
8. Usando um pincel esterilizado em etanol, transfira os ovos da lateral da bucha para a dieta estéril. Transfira os ovos individualmente ou em pequenos lotes. Apontar para 30-50 ovos por frasco. Deixe as tampas soltas para permitir que o oxigênio entre no tubo. Se os frascos para injetáveis devem permanecer axênicos, transfira para uma incubadora de insetos; caso contrário, adicione bactérias como abaixo.

2. Faça moscas gnotobióticas usando 4 espécies bacterianas

1. Prepare bactérias
   1. Prepare uma cabine de biossegurança esterilizada com os suprimentos necessários (pipetas, caixas de ponteiras de pipeta, tubos de centrífuga esterilizados, caldo MRS e racks de tubos de ensaio) como na etapa 1.1. Limpe a parte externa dos tubos de ensaio com um lenço de laboratório embebido em etanol antes de colocá-los no gabinete de biossegurança.
   2. Pulverize as bactérias transferindo primeiro 500 μl de crescimento noturno para um tubo de microcentrífuga estéril. Se a densidade bacteriana for baixa, adicione até 1,5 ml a cada tubo ou remova sequencialmente o sobrenadante e adicione cultura extra ao mesmo tubo. Remova as amostras do gabinete de biossegurança e centrifugue por 10 min a 10.000 x g. Use pontas de filtro para evitar contaminação entre amostras.
   3. Determine a densidade de cada cultura medindo OD₆₀₀. Se estiver usando um leitor de placas de vários poços, transfira 200 μl de cada cultura para uma placa de 96 poços em diluições de 1, 2 e 4 vezes.
   4. Determinar a quantidade de mMRS a diluir cada sedimento celular (2.1.2) utilizando um espectrofotómetro de leitura de placas e as seguintes equações. Planeje adicionar caldo suficiente para inocular 50 μl em cada frasco para moscas.
      1. Colete leituras OD₆₀₀ para uma diluição 1:1, 1:2 e 1:4 de cada cultura bacteriana em um espectrofotômetro de leitura de placas. Seleccionar a diluição para cada estirpe bacteriana que produza um valor OD₆₀₀ entre 0,1 e 0,2 e utilizar este valor e o factor de diluição correspondente como «O» e «D» nas fórmulas indicadas nos pontos 2.1.4.2 ou 2.1.4.3.
      2. Se estiver usando as 4 espécies descritas aqui, normalize as células para densidades equivalentes de unidade formadora de colônias (UFC) / ml (conversão de OD₆₀₀ para UFC determinada anteriormente em Newell e Douglas, Appl Environ Microbiol. (2014)) usando esta equação:
         E = ((O-B) x V x D)/C
         em que E = volume a ressuspender em pellets (μl), O = OD₆₀₀ bactérias, B = OD₆₀₀ meios em branco, D = diluição em dobras, V = μl de cultura bacteriana antes da centrifugação, C = OD₆₀₀ de constante predeterminada. Consulte Arquivo de código suplementar para obter exemplos de cálculos usando essas equações. Para espectrofotômetros que ficam em branco automaticamente, use “O” no lugar de “O-B”.
         OBSERVAÇÃO: As constantes predeterminadas (unidades OD₆₀₀, normalizadas para 10⁷ UFC ^ml-1, constantes derivadas em Newell e Douglas, Appl Environ Microbiol. (2014)) são os seguintes: A. tropicalis (0,052), A. pomorum (0,038), L. brevis (0,056), L. plantarum (0,077).
      3. Se estiver usando outras espécies bacterianas (nenhuma constante UFC/OD₆₀₀ está disponível), normalize a densidade para OD₆₀₀ = 0,1 usando esta equação:
         E = ((O-B) x V x D)/0,1 OD₆₀₀
         OBSERVAÇÃO: As unidades são as mesmas da etapa 2.1.4.2. Consulte Arquivo de código suplementar para obter exemplos de cálculos usando essas equações.
   5. Na cabine de biossegurança, remova o sobrenadante com uma ponta de pipeta e ressuspenda o pellet em mMRS ou PBS fresco, conforme calculado na etapa 2.1.4.2.
2. Inocular bactérias
   1. Transferir 50 μl da bactéria para os tubos cônicos com dieta estéril e ovos descorionados em gabinete de biossegurança. Adicione bactérias após a transferência do ovo para evitar a contaminação entre os frascos.
   2. Colocar os tubos inoculados numa incubadora a 25 °C.

3. Medir a carga/teste de esterilidade da UFC

1. Para medir a carga de UFC em homogeneizados de moscas de corpo inteiro, transfira 5 moscas (5-7 dias após a eclosão) para um tubo de microcentrífuga de 1,7 ml contendo 125 μl de grânulos de cerâmica e 125 μl de caldo mMRS. Homogeneizar moscas usando um homogeneizador de tecidos por 30 segundos a 4,0 M/seg.
   1. Alternativamente, omita as esferas e homogeneize manualmente em tubos de microcentrífuga com pilões de plástico por 1 min.
   2. Se quantificar a microbiota intestinal, esterilize as moscas para remover micróbios exógenos. Transfira as moscas para um tubo de microcentrífuga contendo 100 μl de etanol a 70% por 1 min, aspire o etanol e transfira para um novo tubo de microcentrífuga para homogeneizações. Se o conteúdo de DNA do intestino for medido, enxágue por 1 min com hipoclorito de sódio a 0,6% antes da lavagem com etanol.
2. Diluir o homogeneizado com 875 μl de mMRS, vórtice durante 5 segundos e pipetar 120 μl de homogenato no primeiro alvéolo de uma placa de microtitulação.
3. Efectuar duas diluições sequenciais 1:8 utilizando 10 μl de homogenato e 70 μl de MRS nos dois alvéolos seguintes.
   1. Retirar 10 μl do primeiro alvéolo e adicioná-lo ao segundo alvéolo contendo 70 μl de MRS. Misturar bem o conteúdo do segundo alvéolo, transferir 10 μl do segundo alvéolo para o terceiro alvéolo contendo 70 μl de MRS e homogeneizar. Isso leva a 3 concentrações totais do homogeneizado original de 1.000 μl: não diluído, 1:8 e 1:64.
4. Transferir 10 μl de cada diluição para uma placa de EMRm (utilizando uma pipeta multicanal, se desejado). Incline ligeiramente o prato para espalhar a diluição vários milímetros pela superfície do ágar e deixe o líquido secar antes de mover a placa. O líquido seca rapidamente na placa se as placas tiverem 2 dias, reduzindo a mistura de duas gotículas vizinhas.
5. Incubar a 30 °C durante 1-2 dias. Remova as placas da incubadora uma vez distintas, as colônias individuais são visíveis e conte a partir de uma diluição com 10-100 colônias isoladas.
6. Calcule a UFC por mosca usando a equação E = C x D/P x V/F, onde E = UFC por mosca, C = número de colônias contadas, D = diluição, P = μl plaqueado, V = volume de mosca homogeneizada e F = número de moscas homogeneizadas.

Representative Results

Materials

Brewer's Yeast	MP Biomedicals, LLC.	903312
Glucose	Sigma Aldrich	158968-3KG
Agar	Fisher–Lab Scientific	fly802010
Welch's 100% Grape Juice Concentrate	Walmart or other grocery store	9116196
Cage: 32 oz. Translucent Round Deli Container	Webstaurant Store	999L5032Y
Translucent Round Deli Container Lid	Webstaurant Store	999YNL500
Stock Bottles	Genesee Scientific	32-130
Droso-Plugs	Genesee Scientific	49-101
Nylon Mesh	Genesee Scientific	57-102
Plastic Bushing	Home Depot	100404002
Plastic Bushing Cap	Home Depot	100153897
Specimen Cup	MedSupply Partners	K01-207067
Repeater M4	Eppendorf	4982000322
50 ml Centrifuge Tubes	TrueLine Centrifuge Tubes	TR2003
Food Boxes	USA Scientific	2316-5001
Lysing Matrix D Bulk	MP Biomedicals, LLC.	116540434
Filter Pipette Tips, 300 µl	USA Scientific	1120-9810
Petri Dishes	Laboratory Product Sales	M089303
Ethanol	Decon Laboratories, INC.	2701
Paintbrush	Walmart	5133
Forceps	Fisher	08-882
Household Bleach (6-8% Hypochlorite)	Walmart	550646751
Universal Peptone	Genesee Scientific	20-260
Yeast Extract	Fisher Scientific	BP1422-500
Dipotassium Phosphate	Sigma Aldrich	P3786-1KG
Ammonium Citrate	Sigma Aldrich	25102-500g
Sodium Acetate	VWR	97061-994
Magnesium Sulfate	Fisher Scientific	M63-500
Manganese Sulfate	Sigma Aldrich	10034-96-5
MRS Powder	Sigma Aldrich	69966-500G
96 Well Plate Reader	BioTek (Epoch)	NA
1.7 ml Centrifuge Tubes	USA Scientific	1615-5500
Filter Pipette Tips, 1,000 µl	USA Scientific	1122-1830
96 Well Plates	Greiner Bio-One	655101
Ceramic Beads	MP Biomedicals, LLC.	6540-434
Tissue Homogenizer	MP Biomedicals, LLC.	116004500
Class 1 BioSafety Cabinet	Thermo Scientific	Model 1395