0 visualizações • 3:55 min. • April 30th, 2023
- Primeiro, colete as moscas no estágio desejado de desenvolvimento e coloque-as em um tubo estéril. Para contar apenas a microbiota interna, esterilize o exterior das moscas submergindo-as em etanol 70%. Para medir a microbiota interna e externa, pule esta etapa de esterilização. Em seguida, triture as moscas em um pequeno volume de meio de crescimento bacteriano usando esferas de cerâmica e um homogeneizador de tecidos, ou manualmente com um pilão. Deve-se tomar cuidado para não introduzir bactérias de fontes externas, para evitar a contaminação das amostras.
Agora você deve ter uma mistura homogênea contendo bactérias que você pode cultivar. Aumente o volume do homogenato usando meio bacteriano líquido. Realize diluições em série do homogeneizado e coloque um volume constante dessas diluições no meio de crescimento sólido apropriado para suas bactérias. À medida que as bactérias crescem, as colônias se formam no prato. Encontre a diluição que tem um intervalo de 10 a 100 colônias para determinar as Unidades Formadoras de Colônias, ou UFC, da amostra.
No protocolo de exemplo, inocularemos moscas estéreis com uma cultura gnotobiótica ou bacteriana definida e coletaremos e mediremos UFCs.
- Use pontas de filtro para transferir 100 microlitros de crescimento durante a noite para um tubo de microcentrífuga estéril. Em seguida, transfira 200 microlitros de cada cultura para uma placa de 96 poços. Remova as amostras do gabinete de biossegurança e centrifugue-as para pellet as bactérias. Depois de fazer diluições de uma, duas e quatro vezes, meça a densidade óptica ou OD600 em um espectrofotômetro de leitura de placas de vários poços.
Depois de obter o OD600, remova o sobrenadante com uma ponta de pipeta e use mMRS novo para ressuspender o pellet. Misture as cepas bacterianas diluídas em proporções iguais para criar um coquetel multiespécie. Transfira 50 microlitros do coquetel para os tubos cônicos contendo a dieta estéril e os ovos descorionados. Certifique-se de adicionar as bactérias após a transferência do ovo para evitar a contaminação entre os frascos. Em seguida, coloque os tubos inoculados em uma incubadora.
Para medir as Unidades Formadoras de Colônias ou UFCs, transfira cinco moscas para um tubo de microcentrífuga de 1,7 mililitro contendo 125 microlitros de esferas de cerâmica e 125 microlitros de caldo mMRS. Homogeneizar as moscas usando um homogeneizador de tecidos. Não deve haver pedaços inteiros restantes. Em seguida, dilua o homogeneizado com 875 microlitros de mMRS, vórtice o homogeneizado por cinco segundos e pipete 120 microlitros no primeiro poço de uma placa de microtitulação.
Remova 10 microlitros do primeiro poço e adicione-o ao segundo poço contendo 70 microlitros de MRS. Misture bem o conteúdo do segundo poço. Em seguida, transfira 10 microlitros do segundo poço para o terceiro poço contendo 70 microlitros de MRS e misture bem. Transfira 10 microlitros de cada diluição para uma placa mMRS. Incline ligeiramente o prato para espalhar a diluição vários milímetros pela superfície do ágar e deixe o líquido secar antes de mover o prato. Remova as placas da incubadora assim que colônias individuais distintas forem visíveis e conte-as a partir de uma diluição com 10 a 100 colônias isoladas. Finalmente, calcule a UFC por mosca.