Neste vídeo-artigo apresentamos um método para isolar um ou vários Drosophila da a partir de larvas de terceiro estádio usando a captura de infravermelho (IR) da classe Laser Microdissecção Capture (LCM). RNA obtido a partir de neurônios isolados podem ser facilmente usados para aplicações a jusante, incluindo qRT-PCR ou microarray análises.
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Artigo de método
Laser Microdissecção Captura de Drosophila Neurônios periféricos
Neste artigo
Resumo
Resumo
A arborização dendrítica (da) neurônios do sistema nervoso periférico Drosophila (PNS) fornecer um sistema modelo excelente para investigar os mecanismos moleculares subjacentes à classe específico 1,2 morfogênese dendrite. Para facilitar a análise molecular de classe específico da neurônio desenvolvimento, é vital para obter essas células em uma população pura. Embora uma gama de células diferentes, e específicos do tecido técnicas de isolamento de RNA existem para células Drosophila, incluindo a purificação de células grânulo magnético baseado 3,4, separação de células fluorescentes Ativado (FACS) 5-8, e proteína RNA ligação estratégias baseadas 9, nenhum dos estes métodos podem ser facilmente utilizadas para isolar um ou vários de classe específica de neurônios da drosófila com um alto grau de precisão espacial. Laser Microdissecção Capture (LCM) emergiu como uma ferramenta extremamente poderosa que pode ser usado para isolar tipos específicos de células a partir de secções de tecido com um alto grau de resolução espacial e precisão. RNA obtido a partir de células isoladas podem então ser usados para análises incluindo qRT-PCR e perfil de expressão microarray dentro de um tipo de célula dada 10-16. Até à data, LCM não tem sido amplamente aplicado na análise de tecidos e células Drosophila 17,18, incluindo os neurônios da na terceira fase larval estádio de desenvolvimento.
Aqui apresentamos o nosso protocolo otimizado para o isolamento de neurônios da drosófila usando a classe infravermelho (IR) da LCM. Este método permite a captura de único, específico de classe ou múltiplos neurônios da alta especificidade e com resolução espacial. Pareados por idade larvas de terceiro estádio expressando um UAS-mCD8:: GFP transgene 19 sob o controle de qualquer um da classe IV da neurônio específico ppk-GAL4 20 driver ou o pan-da neurônio específico 21-7-21 GAL4 motorista foram utilizados para estes experimentos. RNA obtido a partir de neurônios isolados da é de qualidade muito alta e pode ser usado diretamente para aplicações a jusante, incluindo qRT-PCR ou microarray análises. Além disso, este protocolo LCM podem ser facilmente adaptadas para capturar outros tipos de células Drosophila um vários estágios de desenvolvimento depende do tipo específico de célula, padrão de expressão GAL4-driven da GFP.
Protocolo
Comentários gerais sobre LCM de Drosophila periférica Neurônios
Permitir que a partir de 6 horas, até uma semana ou mais para LCM, dependendo do tipo de tecido eo número de células necessárias.
Todos os procedimentos são realizados em estrita RNAse-free condições seguintes procedimentos padrão. Larvas expressar tanto 21-7-GAL4, UAS-mCD8:: GFP ou ppk-GAL4, UAS-mCD8:: Linhas repórter GFP transgênicas foram utilizados para esses experimentos.
1. Preparando as larvas
- Coletar 30-40 pareados por idade larvas de terceiro estádio e lave-os em DD....
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Discussão
O protocolo aqui apresentado descreve o nosso método otimizado para o isolamento de neurônios periféricos Drosophila via LCM. Embora este protocolo LCM foi projetado para o isolamento específico de único, específico de classe ou múltiplos neurônios da Drosophila a partir da fase de terceiro instar larval de desenvolvimento, pequenas modificações do protocolo pode ser facilmente adaptado para a captura de outros tipos de células Drosophila desenvolvimento de todos os estágios usando GAL4 di.......
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Divulgações
Não há conflitos de interesse declarados.
Agradecimentos
Agradecemos a drs. Yuh-Nung Jan e Wes Grueber para a prestação de stocks voar utilizados neste estudo, e Virginia Espina, Dr. Emanuel Petricoin e Dr. Lance Liotta para assistência com LCM. Os autores agradecem o F. Thomas e Kate Miller Jeffress Memorial Trust para apoio a esta pesquisa (DNC) e George Mason University Provost Escritório s (EPRI).
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Materiais
Equipamento:
- Criostato
- 50 tubo cônico ml para a fixação de slide, lavagem de tratamento, tripsina e etanol / xileno desidratação
- -80 ° C freezer
- Incubadora
- PixCell IIe Instrumento LCM com Fluor 300 óptica de epifluorescência otimizado para EGFP (Molecular Devices-Molecular Devices)
Referências
- Corty, M. M., Matthews, B. J., Grueber, W. B. Molecules and mechanisms of dendrite development in Drosophila. Development. 136, 1049-1061 (2009).
- Parrish, J. Z., Emoto, K., Kim,, Jan, Y. N. Mechanisms that regulate establishment, maintenance, and remodeling ....
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Reimpressões e permissões
