Artigo de método

Isolamento T de linfócitos humanos, Cultura e Análise da Migração In Vitro

DOI:

10.3791/2017

⸱

1 de junho de 2010

 , 
1Center for Vaccine Biology and Immunology, University of Rochester

Neste artigo

Resumo

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Migração de linfócitos T ocorre durante homing para órgãos linfóides, saia do vasculatura, e entrando em tecidos periféricos. Aqui, nós descrevemos um protocolo que pode ser usado para analisar migração de linfócitos T In vitro.

Resumo

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A migração de linfócitos T envolve a interação adesivo de integrinas da superfície celular com ligantes expressos em outras células ou com proteínas da matriz extracelular. A ativação das integrinas preciso espaço-temporal de um estado de baixa afinidade para um estado de alta afinidade no limite da célula líder é importante para a migração de linfócitos T

Protocolo

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1. Isolamento de linfócitos T humanos

  1. Obter sangue humano a partir de um doador saudável. Permitir que o sangue esfriar até a temperatura ambiente (~ 30 min) antes de prosseguir para a próxima etapa.
  2. Suavemente pipeta de 3 mL de temperatura ambiente Polymorph media gradiente de densidade em um tubo de poliestireno 8 mL de fundo redondo. Delicadamente adicionar 3 mL de sangue total em cima da mídia Polymorph. É importante evitar a mistura dos dois reagentes.
  3. Centrifugar os tubos a 500 xg por 45 minutos em temperatura ambiente.
  4. Após a centrifugação, as células mononucleares do sangue periférico (PBMC) já separado de outros compo....

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Discussão

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Neste experimento, nós fornecemos detalhes sobre um sistema simples para analisar a motilidade do principal linfócitos T humanos. Ensaios de migração in vitro têm sido usadas para dissecar os papéis de muitas moléculas e vias de sinalização envolvidas na locomoção de vários tipos de células. Alguns controles fundamentais para manter em mente ao projetar sua própria experiência de nosso protocolo incluem: 1) não-adesiva ou não-integrina revestimentos adesivos, substratos tais como albumina de soro bovin.......

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Divulgações

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Não há conflitos de interesse declarados.

Agradecimentos

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Este projecto foi apoiado pelo National Institutes of Health Grants HL087088 (MK) e HL18208 (MK).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
RPMI 1640GIBCO, por Life Technologies11875
SFBThermo Fisher Scientific, Inc.SH300070.03
Penicilina-EstreptomicinaGIBCO, por Life Technologies15140
1-Step PolymorphsAccurate Chemical & Scientific CorporationAN221725
PHARemel, Thermo Fisher ScientificR30852801
IL-2 humana recombinanteR&D Systems202-IL
IL-15 humana recombinanteR&D Systems247-IL
Proteína GSigma-Aldrich19459
ICAM-1/Fc humana recombinanteR&D Systems720-IC
SDF-1 humana recombinanteR&D Systems350-NS

Referências

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  1. Hyun, Y. M., Chung, H. L., McGrath, J. L., Waugh, R. E., Kim, M. Activated integrin VLA-4 localizes to the lamellipodia and mediates t cell migration on VCAM-1. J Immunol. 183, 359-369 (2009).
  2. Morin, N. A., Oakes, P. W., Hyun, Y. M., Lee, D., Chin, Y. E., King, M. R., Springer, T. A., Shimaoka, M., Tang, J. X., Reichner, J. S., Kim, M.

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Etiquetas

Ensaio de Migra o CelularRevestimento com ICAM 1Estimula o com SDF 1An lise por Citometria de FluxoImagem por MicroscopiaBloqueio de IntegrinasInibi o da ActomiosinaEstimula o com PHAGradiente de Densidade de Polimorfonucleares

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