Migração de linfócitos T ocorre durante homing para órgãos linfóides, saia do vasculatura, e entrando em tecidos periféricos. Aqui, nós descrevemos um protocolo que pode ser usado para analisar migração de linfócitos T In vitro.
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Artigo de método
Isolamento T de linfócitos humanos, Cultura e Análise da Migração In Vitro
Neste artigo
Resumo
Resumo
A migração de linfócitos T envolve a interação adesivo de integrinas da superfície celular com ligantes expressos em outras células ou com proteínas da matriz extracelular. A ativação das integrinas preciso espaço-temporal de um estado de baixa afinidade para um estado de alta afinidade no limite da célula líder é importante para a migração de linfócitos T
Protocolo
1. Isolamento de linfócitos T humanos
- Obter sangue humano a partir de um doador saudável. Permitir que o sangue esfriar até a temperatura ambiente (~ 30 min) antes de prosseguir para a próxima etapa.
- Suavemente pipeta de 3 mL de temperatura ambiente Polymorph media gradiente de densidade em um tubo de poliestireno 8 mL de fundo redondo. Delicadamente adicionar 3 mL de sangue total em cima da mídia Polymorph. É importante evitar a mistura dos dois reagentes.
- Centrifugar os tubos a 500 xg por 45 minutos em temperatura ambiente.
- Após a centrifugação, as células mononucleares do sangue periférico (PBMC) já separado de outros compo....
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Discussão
Neste experimento, nós fornecemos detalhes sobre um sistema simples para analisar a motilidade do principal linfócitos T humanos. Ensaios de migração in vitro têm sido usadas para dissecar os papéis de muitas moléculas e vias de sinalização envolvidas na locomoção de vários tipos de células. Alguns controles fundamentais para manter em mente ao projetar sua própria experiência de nosso protocolo incluem: 1) não-adesiva ou não-integrina revestimentos adesivos, substratos tais como albumina de soro bovin.......
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Divulgações
Não há conflitos de interesse declarados.
Agradecimentos
Este projecto foi apoiado pelo National Institutes of Health Grants HL087088 (MK) e HL18208 (MK).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| RPMI 1640 | GIBCO, por Life Technologies | 11875 | |
| SFB | Thermo Fisher Scientific, Inc. | SH300070.03 | |
| Penicilina-Estreptomicina | GIBCO, por Life Technologies | 15140 | |
| 1-Step Polymorphs | Accurate Chemical & Scientific Corporation | AN221725 | |
| PHA | Remel, Thermo Fisher Scientific | R30852801 | |
| IL-2 humana recombinante | R&D Systems | 202-IL | |
| IL-15 humana recombinante | R&D Systems | 247-IL | |
| Proteína G | Sigma-Aldrich | 19459 | |
| ICAM-1/Fc humana recombinante | R&D Systems | 720-IC | |
| SDF-1 humano recombinante | R&D Systems | 350-NS |
Referências
- Hyun, Y. M., Chung, H. L., McGrath, J. L., Waugh, R. E., Kim, M. Activated integrin VLA-4 localizes to the lamellipodia and mediates t cell migration on VCAM-1. J Immunol. 183, 359-369 (2009).
- Morin, N. A., Oakes, P. W., Hyun, Y. M., Lee, D., Chin, Y. E., King, M. R., Springer, T. A., Shimaoka, M., Tang, J. X., Reichner, J. S., Kim, M.
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Reimpressões e permissões
