Ensaio de resposta fotomotora: um método para medir a resposta comportamental de larvas de peixe-zebra a uma mudança repentina na condição de iluminação

1. Calibração de parâmetros de rastreamento de vídeo

1. Antes das medidas comportamentais, defina os parâmetros de observação e calibração no software da faixa de vídeo (consulte a Tabela de Materiais).
   1. Coloque uma placa de poço na câmara de registro com pelo menos 1 peixe larval em um poço individual. Use a placa e os peixes associados como representações para definir os parâmetros de calibração.
   2. No software de rastreamento de vídeo, clique em "Arquivo | Gerar protocolo", que abrirá uma caixa de diálogo "assistente de criação de protocolo". No campo "Contagem de locais", insira o número de poços individuais da placa do poço e clique em "OK".
   3. Na parte superior da tela, clique em "Exibir | Tela cheia", que solicitará que o sistema exiba uma visão aérea da câmera da placa do poço.
   4. Clique no ícone "Desenhar áreas", que aparece como três formas multicoloridas. À direita da área de visualização da placa do poço, selecione o ícone de círculo no campo denominado "Áreas".
   5. Use o cursor para delinear a área de rastreamento de vídeo circular no poço superior esquerdo da placa do poço. Selecione "Marca superior direita" e, em seguida, contorne a área de visualização do canto superior direito. Em seguida, selecione "Bottom Mark" para contornar bem o canto inferior direito.
      NOTA: Depois de desenhar o contorno circular, sua posição provavelmente precisará ser ajustada. Para ajustar a posição do contorno, clique em "selecionar" e use o cursor para mover a área delineada. Além disso, os contornos podem ser replicados clicando em "Copiar" e depois em "Colar".
   6. Depois que as áreas de rastreamento de poços superior esquerda, superior direita e inferior direita forem definidas, clique em "Construir" para solicitar que o software delineie automaticamente as áreas de visualização dos poços restantes.
   7. Na área denominada "Calibração", clique em "Desenhar escala". Use o cursor para desenhar uma linha horizontal na placa. Assim que a linha for desenhada, uma caixa de diálogo chamada "Medição de calibração" aparecerá. Insira o comprimento da placa do poço e clique em "OK".
   8. Saia do gerenciador de desenho clicando no ícone "Desenhar áreas".
   9. Clique no ícone "Blocos". Usando o cursor, destaque todas as caixas que aparecem na tela de visualização para que cada caixa fique verde.
      NOTA: O ícone Blocos aparece como um grupo de seis pequenos quadrados individuais
   10. "Clique em Exibir| Tela cheia". À direita da placa viewárea, clique em "Bkg" na caixa "Limite de detecção". Use a barra de ajuste de limite para definir o limite de detecção de pixels. Uma vez selecionado o limite de detecção de pixels apropriado, clique em "Aplicar ao Grupo".
       NOTA: Este protocolo define o limite de detecção em 13 no modo preto para observações de peixe-zebra e em 110 no modo transparente para observações de peixinhos gordos.
   11. Na caixa "Limite de movimento", insira os parâmetros de rastreamento de velocidade de movimento desejados. Uma vez definidos os parâmetros de velocidade, clique em "Aplicar ao Grupo".
       NOTA: Este protocolo define movimentos pequenos/grandes em 20 mm/s e movimentos inativos/pequenos em 5 mm/s. Essas seleções programam o software para rastrear o movimento das larvas de peixes em três níveis de velocidade diferentes: inativo (congelamento) = <5 mm >20 mm / s.
   12. Clique em "Parâmetros | Parâmetros de protocolo" no menu suspenso. Na caixa de diálogo, selecione a guia "Tempo". Insira o tempo de observação e o tempo de integração. Depois que os parâmetros forem inseridos, clique em "Ok".
   13. Para definir os tempos de fotoperíodo claro/escuro e a intensidade da luz para cada fotoperíodo, abra a caixa de diálogo de configurações do driver de luz selecionando "Light Driving" no menu suspenso "Parâmetros".
       NOTA: Consulte o vídeo do protocolo para definir vários fotoperíodos claros e escuros.
   14. Após a definição dos parâmetros de rastreamento de vídeo, salve o protocolo de observação.
       NOTA: Este protocolo observa o comportamento dos peixes durante um período de 50 minutos que inclui uma fase de aclimatação de 10 minutos seguida por 4 fases de alteração de luz / escuridão que consistem em dois períodos de luz de 10 minutos e dois períodos de escuridão de 10 minutos. O tempo de integração é definido para medir o comportamento para cada minuto do teste comportamental de 50 minutos.

2. Observação do comportamento locomotor e fotomotor de larvas de peixes

1. Coloque a placa de poço contendo peixes experimentais na câmara de registro comportamental.
2. No software de rastreamento de vídeo, abra o protocolo de rastreamento desenvolvido na próxima etapa.
3. No visualizador de rastreamento de vídeo, verifique se todas as larvas estão visíveis na tela do computador, se apenas uma larva individual está presente em cada poço e se os poços individuais estão alinhados dentro das áreas de observação definidas nas etapas 1.1.5 e 1.1.6.
4. Clique em "Experimento | Executar".
   NOTA: O sistema solicitará que o usuário forneça um nome e local para salvar os dados de observação.
5. Uma vez especificado o nome e o local de salvamento dos dados de observação, clique no ícone "Várias imagens ao vivo" para destacar todas as áreas de visualização predefinidas
   NOTA: Este ícone está localizado na parte superior da tela do computador e aparece como uma caixa dividida em quatro quadrados menores. Clicar neste ícone destacará todas as áreas de visualização predefinidas.
6. Feche o painel da câmara de gravação e clique em "Plano de fundo | Iniciar" no monitor do computador.