1. Calibração de parâmetros de rastreamento de vídeo
- Antes das medidas comportamentais, defina os parâmetros de observação e calibração no software da faixa de vídeo (consulte a Tabela de Materiais).
- Coloque uma placa de poço na câmara de registro com pelo menos 1 peixe larval em um poço individual. Use a placa e os peixes associados como representações para definir os parâmetros de calibração.
- No software de rastreamento de vídeo, clique em "Arquivo | Gerar protocolo", que abrirá uma caixa de diálogo "assistente de criação de protocolo". No campo "Contagem de locais", insira o número de poços individuais da placa do poço e clique em "OK".
- Na parte superior da tela, clique em "Exibir | Tela cheia", que solicitará que o sistema exiba uma visão aérea da câmera da placa do poço.
- Clique no ícone "Desenhar áreas", que aparece como três formas multicoloridas. À direita da área de visualização da placa do poço, selecione o ícone de círculo no campo denominado "Áreas".
- Use o cursor para delinear a área de rastreamento de vídeo circular no poço superior esquerdo da placa do poço. Selecione "Marca superior direita" e, em seguida, contorne a área de visualização do canto superior direito. Em seguida, selecione "Bottom Mark" para contornar bem o canto inferior direito.
NOTA: Depois de desenhar o contorno circular, sua posição provavelmente precisará ser ajustada. Para ajustar a posição do contorno, clique em "selecionar" e use o cursor para mover a área delineada. Além disso, os contornos podem ser replicados clicando em "Copiar" e depois em "Colar".
- Depois que as áreas de rastreamento de poços superior esquerda, superior direita e inferior direita forem definidas, clique em "Construir" para solicitar que o software delineie automaticamente as áreas de visualização dos poços restantes.
- Na área denominada "Calibração", clique em "Desenhar escala". Use o cursor para desenhar uma linha horizontal na placa. Assim que a linha for desenhada, uma caixa de diálogo chamada "Medição de calibração" aparecerá. Insira o comprimento da placa do poço e clique em "OK".
- Saia do gerenciador de desenho clicando no ícone "Desenhar áreas".
- Clique no ícone "Blocos". Usando o cursor, destaque todas as caixas que aparecem na tela de visualização para que cada caixa fique verde.
NOTA: O ícone Blocos aparece como um grupo de seis pequenos quadrados individuais
- "Clique em Exibir| Tela cheia". À direita da placa viewárea, clique em "Bkg" na caixa "Limite de detecção". Use a barra de ajuste de limite para definir o limite de detecção de pixels. Uma vez selecionado o limite de detecção de pixels apropriado, clique em "Aplicar ao Grupo".
NOTA: Este protocolo define o limite de detecção em 13 no modo preto para observações de peixe-zebra e em 110 no modo transparente para observações de peixinhos gordos.
- Na caixa "Limite de movimento", insira os parâmetros de rastreamento de velocidade de movimento desejados. Uma vez definidos os parâmetros de velocidade, clique em "Aplicar ao Grupo".
NOTA: Este protocolo define movimentos pequenos/grandes em 20 mm/s e movimentos inativos/pequenos em 5 mm/s. Essas seleções programam o software para rastrear o movimento das larvas de peixes em três níveis de velocidade diferentes: inativo (congelamento) = <5 mm / s, pequeno (cruzeiro) = 5–20 mm / s e grande (estouro) = >20 mm / s.
- Clique em "Parâmetros | Parâmetros de protocolo" no menu suspenso. Na caixa de diálogo, selecione a guia "Tempo". Insira o tempo de observação e o tempo de integração. Depois que os parâmetros forem inseridos, clique em "Ok".
- Para definir os tempos de fotoperíodo claro/escuro e a intensidade da luz para cada fotoperíodo, abra a caixa de diálogo de configurações do driver de luz selecionando "Light Driving" no menu suspenso "Parâmetros".
NOTA: Consulte o vídeo do protocolo para definir vários fotoperíodos claros e escuros.
- Após a definição dos parâmetros de rastreamento de vídeo, salve o protocolo de observação.
NOTA: Este protocolo observa o comportamento dos peixes durante um período de 50 minutos que inclui uma fase de aclimatação de 10 minutos seguida por 4 fases de alteração de luz / escuridão que consistem em dois períodos de luz de 10 minutos e dois períodos de escuridão de 10 minutos. O tempo de integração é definido para medir o comportamento para cada minuto do teste comportamental de 50 minutos.
2. Observação do comportamento locomotor e fotomotor de larvas de peixes
- Coloque a placa de poço contendo peixes experimentais na câmara de registro comportamental.
- No software de rastreamento de vídeo, abra o protocolo de rastreamento desenvolvido na próxima etapa.
- No visualizador de rastreamento de vídeo, verifique se todas as larvas estão visíveis na tela do computador, se apenas uma larva individual está presente em cada poço e se os poços individuais estão alinhados dentro das áreas de observação definidas nas etapas 1.1.5 e 1.1.6.
- Clique em "Experimento | Executar".
NOTA: O sistema solicitará que o usuário forneça um nome e local para salvar os dados de observação.
- Uma vez especificado o nome e o local de salvamento dos dados de observação, clique no ícone "Várias imagens ao vivo" para destacar todas as áreas de visualização predefinidas
NOTA: Este ícone está localizado na parte superior da tela do computador e aparece como uma caixa dividida em quatro quadrados menores. Clicar neste ícone destacará todas as áreas de visualização predefinidas.
- Feche o painel da câmara de gravação e clique em "Plano de fundo | Iniciar" no monitor do computador.