Ensaio de captura de presas: um método para estudar o comportamento de captura de presas de larvas de peixe-zebra

Resumo

Fonte: Muto, A., et al. Ablação de uma população neuronal usando um laser de dois fótons e sua avaliação usando imagens de cálcio e registro comportamental em larvas de peixe-zebra. J. Vis. Exp.(2018)

Este vídeo descreve o ensaio de captura de presas. O vídeo discute o método para estudar o comportamento de captura de presas de larvas de peixe-zebra após a ablação a laser de neurônios específicos.

Protocolo

1. Avaliação das consequências comportamentais após a ablação a laser

1. Configure um sistema de gravação comportamental que consiste em um estereoscópio equipado com uma câmera de vídeo. Use uma câmera com um software de aquisição de imagem apropriado, comercial ou personalizado (Figura 1A).
2. Otimize a condição de iluminação para que o paramécio possa ser detectado pelo processamento de imagens. Por exemplo, use uma luz LED branca de anel com espaçador (Figura 1B).
   Nota: A distância e o ângulo do LED afetam a aparência da amostra (ou seja, claro em fundo escuro ou escuro em fundo claro) e, portanto, são críticos para o processamento de imagem bem-sucedido. Determine a melhor altura do espaçador (Figura 1C).
3. Coloque uma larva de peixe-zebra (recuperada do experimento de ablação a laser descrito na Seção 1) em uma câmara de registro comportamental (que foi presa a uma lâmina de vidro) com o selo superior original removido (Figura 1D).
4. Recolher 50 paramécios suspensos em água do copo com uma micropipeta e colocá-los na câmara de registo.
5. Coloque uma lamínula em cima da câmara de gravação. Coloque uma pequena gota de água na lamínula antes de colocá-la na superfície da água da câmara de gravação para evitar a introdução de ar na câmara.
   Nota: Nesta etapa, um pouco de água com paramecia transbordará da câmara de gravação. O número restante de paramécios na câmara de gravação será de aproximadamente 30-40.
6. Coloque a câmara de registro (contendo uma larva e paramécia) no sistema de iluminação (Figura 1D).
7. Inicie a gravação em time-lapse a 10 fps durante 11 min (6 600 fotogramas).
8. (Opcional) Para cada larva que foi testada quanto ao comportamento, observe a fluorescência das áreas ablacionadas a laser por microscopia fluorescente para confirmar a eficácia da ablação a laser (ou seja, ausência ou número significativamente reduzido de células fluorescentes na área irradiada com laser).
   Nota: Mesmo após a irradiação, algumas células fluorescentes ainda podem ser observadas devido ao início tardio da expressão do gene Gal4 em células que se diferenciaram após a ablação.
9. Depois de registrar o comportamento da larva, para compensar a falta de uniformidade no fundo, execute uma divisão pixel a pixel de cada quadro por uma imagem média em Fiji: clique em 'Processo', 'Calculadora de imagem', 'Operação: Dividir', 'Resultado de 32 bits (flutuante)' e 'OK'. Para criar uma imagem média, clique em 'Imagem', 'Pilhas', 'Projeto Z', 'Intensidade média' e 'OK' (Figura 1E, F).
10. Conte o número de paramécios restantes na câmara clicando em 'Analisar', 'Analisar partículas', definindo um intervalo de área que cubra todos os paramécios, marcando a caixa de seleção 'Mostrar:Máscaras' e clicando em 'OK'. A opção 'Mostrar:Máscaras' fornecerá uma imagem de paramécia extraída (Figura 1G), com uma lista do número de partículas (paramécia) em cada quadro.
11. Plote o número de paramécios deixados na câmara de gravação ao longo do tempo. Como as estimativas do número de paramécios são ruidosas, recomendamos realizar uma média móvel em cada ponto em um intervalo de 600 quadros (1 min) na planilha.

Resultados

Figura 1. Ensaio de captura de presas e dados representativos em larvas de peixe-zebra com ablação a laser.(A) Sistema de registro comportamental. O estereomicroscópio foi equipado com uma câmera CMOS. As imagens foram adquiridas usando um roteiro personalizado. (B) Componentes do sistema de iluminação. Um papel de cor cinza, um difusor de vidro, anel de luz LED branco, difusor, um espaç...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Câmaras de imagem	Grace Bio-Labs	Câmaras de imagem CoverWell PCIA-2.5	Usado como uma câmara de gravação comportamental
ORCA-Flash 4.0	Fotônica de Hamamatsu	Modelo: C11440-22CU	Uma câmera CMOS científica
SZX7	Olimpo		Estereoscópio
Uma luz LED de anel	Ccs	Modelo: LDR2-100SW2-LA	LED branco
Junta da câmara de hibridização Secure-Seal, 8 câmaras, 9 mm de diâmetro x 0,8 mm de profundidade	Sondas Moleculares	Catálogo # S-24732	Usado como uma câmara de gravação em imagens de Ca