Ensaio de resposta de escape: um método para estudar a resposta de larvas de peixe-zebra a estímulos de toque

Resumo

Fonte: Sztal, T. E., et al. Usando ensaios de resposta evocada ao toque e locomoção para avaliar o desempenho e a função muscular em peixe-zebra. J. Vis.(2016)

Este vídeo descreve o ensaio de resposta de evocação de toque, que mede a resposta da larva do peixe-zebra aos estímulos de toque.

Protocolo

1. Ensaio de resposta evocada por toque

1. Preparação de 2 embriões dpf para ensaio de resposta evocada ao toque
   1. Certifique-se de que a hora do dia em que o teste é realizado seja consistente entre os experimentos, pois a atividade pode variar drasticamente ao longo do dia.
      NOTA: O experimento deve ser realizado às cegas e a ordem dos testes deve ser randomizada para minimizar os artefatos experimentais.
   2. Atribua às estirpes de peixes um número desconhecido para o indivíduo que realiza a experiência. Em seguida, o uso de ferramentas online disponíveis gratuitamente gera uma lista aleatória que dita a ordem dos testes.
   3. Pelo menos uma hora antes do teste, descorione os embriões fazendo um buraco no córion e separando-o suavemente usando uma pinça fina. Remover quaisquer detritos da placa de Petri antes de regressar à incubadora a 28 °C.
2. Realização do ensaio de resposta evocada por toque
   1. Aqueça o estágio a 28 °C pelo menos 15 min antes de iniciar o teste.
      NOTA: Este stage é controlado por temperatura e permanecerá a 28 °C durante o teste. A temperatura afetará a atividade e, portanto, é importante manter uma temperatura constante. Se um estágio aquecido não estiver disponível, a temperatura da água deve ser monitorada e todos os experimentos devem ser conduzidos na mesma temperatura.
   2. Coloque uma placa de Petri cheia de meio embrionário (5 mM NaCl, 0.17mM KCl, 0.33 mM CaCl₂, 0.33 mM MgSO₄ em água) em um iluminado stage e monte a câmera de alta velocidade sobre a placa de Petri.
   3. Inicie o software de gravação da câmera de vídeo (como o Stream Pix 5, descrito aqui) e, na guia "espaço de trabalho", selecione 1.000 quadros por segundo (1.000 fps) como a velocidade de captura para garantir que a ação rápida de natação do peixe seja gravada.
   4. Trabalhando com um embrião de cada vez, coloque o embrião no meio da placa de Petri com o peixe-zebra claramente visível no campo de visão.
      NOTA: Se o embrião nadar para longe antes do início do experimento, substitua-o por outro, pois a recaptura e o posicionamento do embrião podem resultar em sua dessensibilização ao estímulo e respostas repetidas de explosão podem promover fraqueza muscular em alguns modelos de doenças.
   5. Comece a gravar clicando no botão "gravar" e entregue o estímulo mecanossensorial ao embrião tocando-o suavemente com uma agulha romba no topo da cabeça.
   6. Interromper a gravação depois que o embrião nadar para fora do campo de visão ou retornar ao repouso.
      NOTA: A aceleração atinge o pico nos primeiros 0,2 segundos da resposta de escape de explosão após o estímulo mecânico. Por conseguinte, certifique-se de que, pelo menos durante os primeiros 0,2 segundos do registo da resposta de fuga, o peixe se encontra no campo de visão. Usando o software Stream Pix 5, os dados serão salvos automaticamente como um arquivo de vídeo .avi. Softwares alternativos de captura de vídeo, como Free Video Capture ou Softonic, ambos disponíveis gratuitamente para download, também podem ser usados.
   7. Retorne o embrião para uma nova placa de Petri e selecione outro embrião para teste. Realize testes em um mínimo de 15 peixes.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Placas de Petri de 90 mm	Produtos de laboratório do Pacífico	PT S90001
Pinças, estilo 8	Tecnologia ProSciTech	T04-821
incubadora	Thermoline Científica	TEI-43L
Câmera de alta velocidade	Baumer	HXC20
StreamPix5	NorPix		Passo 1.2.3
Unidade de controle de temperatura	ponto de vista
http://www.randomization.com	N/A		Passos 1.1.2