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1. Transferência da Biblioteca de Pequenas Moléculas
Embora a transferência de compostos possa ser automatizada com métodos de transferência robótica, descreveremos o método de transferência manual.
- As bibliotecas de moléculas pequenas são normalmente fornecidas em um formato de 96 poços, com cada composto armazenado em DMSO como um estoque de 10 mM. Cerca de 60 minutos antes de os embriões atingirem o estágio em que os compostos serão adicionados, descongele um número desejado de placas de 96 poços contendo alíquotas de pequenas moléculas (placa de origem). Anote o número de série ou outro número de identificação das placas de origem. Para minimizar a condensação nas placas, o descongelamento pode ocorrer em uma câmara de dessecação contendo Drierite (W.A. HAMMOND DRIERITE CO, Xenia, OH).
- Gire brevemente as placas em uma centrífuga de mesa equipada com adaptador de placa de vários poços.
- Remova a fita de vedação de alumínio da placa de origem. Usando uma pipeta de 12 canais, dilua os compostos na placa de origem até a concentração de 0,5 mM (por exemplo, se começar com alíquotas de 250 nL de estoque de 10mM, adicione 4,75 μL de DMSO a cada poço).
- Quando os embriões na placa de 96 poços (placa receptora) atingirem o estágio desejado, use uma pipeta de 12 canais (2-20 μL) para transferir 2,5 μL de compostos (0,5 mM) das placas de origem para as placas receptoras contendo os embriões.
- Registre o número de identificação das placas de origem nas placas de embriões receptores. Cubra as placas receptoras que agora contêm os embriões e compostos com tampas, misture delicadamente as placas girando suavemente e coloque-as em uma incubadora a 28,5 ° C.
- Cubra cada placa de origem contendo pequenas moléculas não utilizadas (0.5 mM) com uma fita de vedação de alumínio e coloque em um freezer a -80 ° C para armazenamento de longo prazo.
2. Triagem de efeitos de pequenas moléculas por inspeção visual de fenótipos
- Antes de realizar a tela, formule um critério específico para o que constituiria um "hit".
- Nos momentos desejados do desenvolvimento, remova as placas de 96 poços contendo embriões tratados com compostos da incubadora e examine cada poço sob um estereomicroscópio. Para melhor visualização de mudanças sutis, como mudanças no padrão circulatório, um microscópio invertido de contraste de fase pode ser usado. A microscopia fluorescente pode ser usada para examinar a perturbação da expressão das proteínas GFP ou DsRed sob um promotor específico do tecido.
- Examine rapidamente as placas de 96 poços em busca de qualquer poço em que pelo menos 3 em cada 5 embriões exibam o fenótipo "hit" prescrito. Registre a identidade da placa e a localização do poço de cada possível acerto.
- Reconfirme um acerto potencial testando novamente os efeitos do composto em várias doses (1 uM, 5 uM, 10 μM e 50 μM). Para cada dose, 10 embriões são testados em 0,5 mL de meio E3 em formato de placa de 48 poços. O momento da adição do composto para o novo ensaio deve ser idêntico ao do rastreio original. Um acerto é confirmado quando o fenótipo eliciado é reproduzido no novo teste do composto
- Identifique o composto atingido no banco de dados de pequenas moléculas na biblioteca química.