1. Preparação de embriões/larvas
- Transferir 100 embriões para uma placa de Petri de 100 mm com 25 ml de água do ovo. Não conservar mais de 100 embriões por placa de Petri e criá-los a 28 °C.
- Para inibir a pigmentação, adicione feniltioureia (PTU) nas placas de Petri antes de 10 horas após a fertilização (hpf) e crie embriões/larvas até 80 hpf. A concentração final de PTU é de 0,2 mM.
CUIDADO: PTU é tóxico. Use de acordo com as diretrizes de manuseio apropriadas.
- Anestesiar as larvas adicionando éster etílico de ácido 3-aminobenzóico (Tricaine), a uma concentração final de 0,016%, nas placas de Petri. Em seguida, usando um microscópio de epifluorescência, classifique as larvas positivas para CFP. Use larvas com tamanho de fígado semelhante e descarte aquelas com fígado menor ou maior.
NOTA: qualquer larva positiva para PFC, independentemente da intensidade, pode ser usada, pois não há diferença na extensão da ablação de hepatócitos entre as larvas hemizigóticas e homozigóticas.
CUIDADO: a tricaína é tóxica. Use de acordo com as diretrizes de manuseio apropriadas.
- Remova a água com ovo contendo Tricaine e adicione água com ovo suplementada com PTU 0.2 mM. Manter os embriões/larvas a 28 °C.
2. Tratamento MTZ
- Prepare uma solução fresca de 10 mM Mtz dissolvendo 0,171 g de pó de Mtz em 100 ml de água de ovo suplementada com 0,2% de DMSO e 0,2 mM de PTU. Para dissolver completamente o Mtz, misture a solução em RT com agitação rápida por 20-30 minutos. Para ajudar a solubilizar Mtz e aumentar a permeação de Mtz nas larvas, adicione DMSO ao preparar Mtz.
CUIDADO: a exposição prolongada ou o aumento da concentração de Mtz são tóxicos. Use de acordo com as diretrizes de manuseio apropriadas.
- Separe as larvas em grupos de controle e experimentais, transferindo o número desejado de larvas para duas placas de Petri de 100 mm ou placas de vários poços diferentes. Para o grupo experimental, manter as larvas em solução de 10 mM Mtz; para o grupo controle, mantenha-os em água com ovo contendo 0,2% de DMSO.
- Cobrir as placas ou placas de Petri que contêm a solução de Mtz com folha de alumínio para evitar a foto-inactivação de Mtz e incubar a 28 °C. A duração do tratamento com Mtz depende do estágio larval e da linhagem transgênica.
3. Análise da regeneração hepática conduzida por vias biliares
- No final do período de ablação, remova a solução de Mtz das placas. Lave as larvas tratadas com Mtz adicionando 25 ml de água de ovo. Gire o prato 2-3 vezes para lavar as larvas antes de descartar a água do ovo. Repita três vezes e depois mergulhe as larvas mais uma vez em água com ovo. Para evitar edema cardíaco e morte larval nas larvas tratadas com Mtz, adicione uma concentração menor de Tricaína, a uma concentração final de 0,008%, para imobilizar as larvas.
- Para análise do fígado, examine o tamanho do fígado das larvas tratadas com Mtz sob um microscópio de epifluorescência com o filtro CFP. Avalie os níveis de ablação de hepatócitos com base no tamanho relativo do fígado: grande (não ablacionado; 0-10% de larvas), médio (parcialmente ablacionado; 10-20%) e muito pequeno (totalmente ablacionado; 80-90%).
