Injeção de morfolino: um método para derrubar a expressão gênica alvo para estudar a função em peixe-zebra

Resumo

Fonte: Hyde D.R., et al. Eletroporação in vivo de morfolinos na barbatana caudal de peixe-zebra adulto em regeneração. J. Vis. Exp. (2012)

O protocolo descreve o knockdown direcionado da expressão gênica em peixe-zebra por injeção de morfolino na cauda.

Protocolo

1. Injeção de morfolino

1. No dia anterior à injeção do morfolino, faça uma placa de injeção (Figura 1). Certifique-se de cortar um entalhe em uma extremidade do poço, o que ajuda a estabilizar o peixe para o procedimento de microinjeção.
2. Diluir o morfolino marcado com fluoresceína até à concentração adequada (recomenda-se começar com 1,2 mM) e colocar num banho-maria a 65 °C, durante 5 minutos.
3. Carregue a agulha com o morfolino (nota: dependendo se você preenche ou carrega a frente, sua agulha determinará se você carrega a agulha primeiro ou corta a ponta primeiro).
4. Corte a ponta da agulha em ângulo.
5. Siga as instruções do seu sistema de microinjeção para injetar uma bolha de aproximadamente 5 nl de morfolino por injeção. Volumes maiores de morfolino podem romper o tecido.
6. Anestesiar o peixe e colocá-lo na placa de injeção. Remova todo o excesso de líquido e oriente a agulha para o local apropriado, logo distal ao raio ósseo (Figura 2). Usando um microscópio e um aparelho de microinjeção apropriado para injeções de morfolino (ver Tabela de Reagentes Específicos), injete o morfolino na barbatana de anterior para posterior, conforme mostrado na Figura 2. A injeção de posterior para anterior faz com que o tecido da barbatana se enrole durante a injeção e é muito difícil.
7. Insira a agulha suavemente no tecido regenerativo, logo distal a cada raio ósseo (marcado com "1" na Figura 2) e empurre distalmente até localizar no blastema (marcado com "2" na Figura 2). Tenha cuidado para não empurrar a agulha por toda a barbatana. Quando a agulha estiver localizada corretamente, injete o morfolino (ou seja, clique uma vez). A 1,2 mM, a solução de morfolino marcada com fluoresceína aparece verde-amarelada, mesmo em condições normais de luz. A cada injeção, um "sopro" amarelo de solução de morfolino pode ser visualizado, o que ajuda a localizar a injeção no blastema. Aproximadamente 75 nl (10-15 cliques) de solução de morfolino devem ser injetados por raio ósseo. Pausa ~ 1 segundo entre cliques. Injetamos apenas o lado dorsal, usando o ventral como controle somente de eletroporação.

Resultados

Figura 1. A. Esquema da placa de injeção, que é feita de agarose e contém um pequeno poço para segurar os peixes durante a microinjeção do morfolino.

Figura 2. Esquema de microinjeção de morfolino. A. Coloque o peixe no prato com a cabeça do peixe no entalhe cortado do poço, o...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Morfolino	GeneTools, LLC		O morfolino deve ser projetado sob medida para a proteína de seu interesse
Bomba de microinjeção	Instrumentos de precisão mundiais, Inc.	PV830	PicoPump pneumático Muitos sistemas diferentes da microinjeção poderiam ser usados
Micro-manipulador	Instrumentos de precisão mundiais, Inc.	MMJR	Destro (MMJL para canhoto)
Agulhas de microinjeção, diâmetro externo de 1,0 mm	Instrumentos de precisão mundiais, Inc.	1B100F-4	Estes são capilares de vidro borossilicato, puxados para uma agulha
Porta-agulhas	Instrumentos de precisão mundiais, Inc.	5430-TODOS	Kit de bicos Pico; certifique-se de inserir a junta da pipeta de 1.0 mm
Extrator de agulhas	Sutter Instrument Co.	Pág. 97	Outros extratores de micropipeta / agulha também devem funcionar
microscópio	Leica, Nikon, Zeiss	O número varia de acordo com o fabricante	Qualquer estereomicroscópio com óptica 20X e capacidade de trabalhar com micromanipuladores
2-fenoxietanol	Sigma-Aldrich	77861-1L	Anestesia; diluir 1:1000 em água do sistema de peixes para procedimento, 1:500 para eutanásia