Acasalamento e estadiamento de ovos: um método para gerar embriões e classificá-los por estágio de desenvolvimento

Abstract

Fonte: Hostelley T.L., et al. Preparação e análise de amostras de dados de expressão gênica baseados em RNASeq de peixe-zebra. J. Vis. Exp. (2017)

O artigo descreve um protocolo para gerar embriões de peixe-zebra por meio de acasalamento natural e classificação de seus estágios de desenvolvimento. O protocolo é usado ainda para análise de células β pancreáticas usando peixes transgênicos.

Protocol

1. Geração de embriões através do acasalamento natural

1. Cultivar embriões até os 3 meses de idade, maturidade reprodutiva.
2. Separe peixes machos e fêmeas adultos da linhagem desejada em tanques de acasalamento divididos na noite anterior à coleta de embriões e adicione 2 machos e 3 fêmeas a cada tanque.
   NOTA: O uso da cepa repórter fluorescente transgênica insulina2a:mCherry permitiu a análise das células β pancreáticas.
3. Transfira o peixe para o tanque de acasalamento com água fresca do sistema e remova a divisória imediatamente após as luzes se acenderem na manhã seguinte.
4. Deixe os peixes acasalarem naturalmente até que os embriões sejam observados no tanque inferior. Colete embriões em intervalos de 30 minutos até que a quantidade desejada seja coletada. Armazenar cada ponto de tempo coletado em placas de Petri separadas em meio embrionário a 28,5 ° C.
5. Realizar microinjeção de material genético ou colocação em meio de cultura experimental, se desejado, e cultivar os embriões em meio embrionário de Hank fresco em placas de Petri de 10 cm a 28,5 °C.
   NOTA: Para análise de expressão gênica em animais injetados ou mutantes com morfolino (MO), observe que cada manipulação pode ter impactos incidentais na expressão gênica. Os mutantes podem exibir compensação genética no nível de transcrição que não é observado pelo direcionamento genético baseado em MO.

2. Embriões em estágio

1. Cultive os embriões em grupos de 50 a 75 embriões por placa de Petri de 10 cm para promover um tempo de desenvolvimento consistente de todos os embriões.
2. Monitore a morfologia do desenvolvimento usando microscópio de dissecação nos estágios de blastômero, epíbolia e somito para garantir a progressão do desenvolvimento.
   NOTA: Remova quaisquer embriões moribundos ou malformados para evitar atrasos no desenvolvimento do prato.
3. Separe os embriões com base na idade de desenvolvimento. Estadiar os embriões e larvas usando o comprimento total do corpo após 24 hpf.
   NOTA: Os somitos são o tecido mesodérmico em forma de divisa presente na parte dorsal do embrião.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
ins2a:mCherry	ZIRC	ZL1483
Tanques de acoplamento 1.0L Conjunto de tanques de cruzamento	Aquaneering	ZHCT100
Microscópio de dissecação	Zeiss