Extração de DNA do clipe da cauda: um método usado na genotipagem do peixe-zebra

Resumo

Fonte: Xing L., et al. Genotipagem rápida e eficiente de peixe-zebra usando PCR com análise de fusão de alta resolução. J. Vis. Exp. (2014).

Este artigo descreve a extração de DNA do clipe da cauda do peixe-zebra. O protocolo demonstra um método rápido e eficiente para analisar genótipos de peixe-zebra.

Protocolo

1. Preparação de DNA

1. Prepare o tampão de lise de DNA: 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl pH 8,3, 0,3% Tween 20, 0,3% NP40. Adicione a proteinase K fresca a uma concentração final de 1 mg / ml no dia do uso.
2. Coleta de tecidos:
   1. Para clipe de barbatana de peixe adulto:
      1. Anestesiar peixes: Coloque os peixes em solução de MS-222 (tricaína) a 0,004%. Espere até que o movimento branquial diminua.
      2. Coloque o peixe em uma pilha de 5 a 10 Kimwipes e corte um pequeno pedaço da barbatana caudal, cerca de 2 a 3 mm, com uma lâmina de barbear estéril.
      3. Coloque rapidamente o peixe em um tanque rotulado com água doce para recuperação; rotule cuidadosamente o tanque e o tubo correspondente que conterá o clipe de barbatana. Troque a água e alimente os peixes em dias alternados.
      4. Pegue o clipe de aleta com uma ponta de pipeta estéril e transfira-o para um tubo cheio de 100 μl de tampão de lise de DNA.
      5. Descarte a ponta da pipeta e descarte a lâmina de barbear em um recipiente para objetos cortantes.
   2. Para clipe de cauda de embrião:
      1. Coloque os embriões em uma solução de MS-222 (tricaína) a 0,004%. Aguarde 2 min.
      2. Corte um pedaço de cauda com uma pinça sob um microscópio de dissecação.
      3. Coloque a cauda em um tubo marcado cheio de 30 μl de tampão de lise de DNA.
      4. Coloque rapidamente o embrião em um tubo contendo 100 μl de paraformaldeído a 4%.
      5. Rotule os tubos com embriões e seus tubos de cauda correspondentes.
      6. Armazenar os tubos com embriões a 4 °C durante a noite para fixação.
      7. Limpe a pinça usando água Milli-Q e Kimwipes entre cada embrião para minimizar a contaminação.
   3. Para embriões inteiros:
      1. Coloque os embriões em uma solução de MS-222 (tricaína) a 0,004%. Aguarde 2 min.
      2. Coloque 1-5 embriões em um tubo cheio de 100 μl de tampão de lise de DNA. A descorionação não é necessária.
3. Digestão de DNA
   Incubar tubos com tecido (barbatanas ou clipes de cauda ou embriões) a 55 °C durante 4 horas até uma noite.
4. Inative a proteinase K
   Tubos de calor a 95 °C por 15 min. O DNA deve ser usado para PCR imediatamente ou armazenado a -20 °C por até 3 meses.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
100 Mix Mestre LightScanner de Reação	BioFogo	HRLS-ASY-0002	www.biofiredx.com
Tricaína
Paraformaldeído