1. Preparação da amostra
<ol>
	<li>Preparando a mistura de agarose
	<ol>
		<li>15 minutos antes de fazer a mistura de agarose, derreta uma alíquota de 1 ml de agarose de baixo ponto de fusão a 1% (dissolvida em meio E3) em um bloco de aquecimento regulado para 70 °C. Quando a agarose estiver completamente fundida, transfira 600 μl para um tubo novo de 1,5 ml, adicione 250 μl de meio E3, 50 μl de 0,4% MS-222 e 25 μl de solução de estoque de grânulos em vórtice. 
		nota: Isso perfaz 925 μl da mistura, enquanto 75 μl adicionais são calculados para o líquido adicionado posteriormente junto com os embriões.</li>
		<li>Mantenha o tubo em um segundo bloco de aquecimento a 38-40 °C ou certifique-se de que a agarose esteja muito próxima de seu ponto de gelificação antes de colocar embriões de amostra nele.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Montando os embriões
	<ol>
		<li>Pegue cinco capilares de vidro de 20 μl de volume (com uma marca preta, ~ 1 mm de diâmetro interno) e insira os êmbolos de ponta de Teflon correspondentes neles. Empurre o êmbolo através do capilar para que a ponta de Teflon fique na parte inferior do capilar.</li>
		<li>Transfira cinco embriões (um número que pode ser montado de uma só vez) com uma pipeta de vidro ou plástico para o tubo de mistura de agarose quente a 37 °C em vórtice. 
		nota: Tente transportar um volume mínimo de líquido junto com os embriões.</li>
		<li>Insira o capilar na mistura e sugue um embrião para dentro, puxando o êmbolo para cima. Certifique-se de que a cabeça do embrião entre no capilar antes da cauda. Evite bolhas de ar entre o êmbolo e a amostra. Deve haver ±2 cm de agarose acima do embrião e ±1 cm abaixo dele. Repita para os embriões restantes.</li>
		<li>Aguarde até que a agarose solidifique completamente, o que acontece em poucos minutos e depois guarde as amostras em meio E3, colando-as na parede de um béquer com plasticina ou fita adesiva. A abertura inferior do capilar deve estar pendurada livre na solução, permitindo a troca gasosa para a amostra. 
		NOTA: Um protocolo semelhante às seções 1.1 e 1.2 também pode ser encontrado na página wiki do OpenSPIM http://openspim.org/Zebrafish_embryo_sample_preparation.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Posicionamento da amostra
<ol>
	<li>Conjunto de suporte de amostra
	<ol>
		<li>Insira 2 mangas de plástico do tamanho certo (pretas) uma contra a outra na haste do porta-amostras. Seus lados de fenda devem estar voltados para fora. Prenda o parafuso de fixação frouxamente girando-o 2-3 rodadas. Insira o capilar através do clamp parafuso e empurre-o através do suporte até que a faixa preta fique visível do outro lado. Evite tocar no êmbolo.</li>
		<li>Aperte o parafuso de fixação. Empurre o excesso de 1 cm de agarose abaixo do embrião para fora do capilar e corte-o. Insira a haste no sample disco porta-amostras.</li>
		<li>Confirme no software se a platina do microscópio está na posição de carga. Use trilhos de guia para deslizar todo o suporte com a amostra verticalmente para baixo no microscópio. Gire-o para que o disco suporte magnético trave na posição.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Microscópio Lightsheet Z.1</td>
			<td>Microscopia Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Baixo ponto de fusão de agarose</td>
			<td>Roth</td>
			<td>Nº 6351.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Baixo ponto de fusão de agarose</td>
			<td>sigma</td>
			<td>A4018 ou A9414</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-aminobenzoato de etilo metanossulfonato (MESAB/MS-222/Tricaína)</td>
			<td>sigma</td>
			<td>E10521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 μl (1 mm de diâmetro interno, marcado em preto) capilares</td>
			<td>marca</td>
			<td>701904</td>
			<td>Vendido como peça de reposição para TransferPettor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Êmbolos de ponta de teflon para capilares de 20 μl</td>
			<td>marca</td>
			<td>701932</td>
			<td>Vendido como peça de reposição para TransferPettor</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparação de amostras de microscopia de folha de luz: montagem de embriões vivos de peixe-zebra para imagens de longo prazo

Fonte: Icha J., et al. <a href="https://www.jove.com/v/53966/" target="_blank">Usando microscopia de fluorescência de folha de luz para obter imagens do desenvolvimento do olho do peixe-zebra</a>. J. Vis. Exp. (2016).
Este artigo descreve a preparação de amostras para microscopia de fluorescência de folha de luz. Ele também demonstra um método para montar embriões vivos de peixe-zebra para imagens de longo prazo, o que permite a gravação de filmes de longo lapso de tempo de embriões vivos em condições quase fisiológicas.

Preparação de amostras de microscopia de folha de luz: montagem de embriões vivos de peixe-zebra para imagens de longo prazo

Fonte: Icha J., et al. Usando microscopia de fluorescência de folha de luz para obter imagens do desenvolvimento do olho do peixe-zebra. J. Vis. Exp. (2016).
Este artigo descreve um exemplo ...

- Primeiro, prepare a agarose adicionando meio E3, que fornece cálcio aos embriões descorionados para a agarose derretida. Em seguida, adicione MS222 para anestesiar embriões. Resfrie a mistura de agarose a 38 graus Celsius, perto de solidificar. Selecione alguns embriões descorionados que expressam proteínas fluorescentes e transfira-os para a mistura de agarose.
Em seguida, insira totalmente um êmbolo em um capilar de vidro e retire um embrião, certificando-se de que ele entre de cabeça primeiro. Assim que a agarose solidificar, use fita adesiva para manter o capilar na posição vertical em um béquer contendo meio E3. O fundo capilar aberto promove a troca gasosa para a amostra de embrião.
Colocar o capilar no suporte de amostras de um microscópio de fluorescência de folha de luz. O laser forma uma fina folha de luz, permitindo que uma objetiva de detecção - posicionada perpendicularmente à amostra - capture uma imagem transversal. No protocolo de exemplo, montaremos embriões de peixe-zebra para obter imagens do olho em desenvolvimento.
Comece preparando a agarose. Derreta uma alíquota preparada de 1 mililitro de agarose de baixo ponto de fusão a 1% em meio E3 a 70 graus Celsius. Após cerca de 15 minutos, transfira 600 microlitros de agarose derretida para um tubo novo de 1,5 mililitro e adicione 250 microlitros de meio E3, 50 microlitros de 0,4% MS222 e 25 microlitros de solução de estoque de esferas fluorescentes em vórtice.
Coloque o tubo em um bloco de aquecimento a cerca de 39 graus Celsius, para permitir que a agarose se aproxime de seu ponto de gelatina. Em seguida, empurre os êmbolos com ponta de Teflon para baixo até a parte inferior dos capilares de vidro de 1 milímetro de diâmetro interno. Prepare cinco deles.
Agora, faça um vórtice breve da mistura de agarose e, em seguida, transfira cinco embriões com uma quantidade mínima de líquido para ela. Em seguida, insira um capilar e aspire um embrião, de cabeça para baixo.
A cabeça deve entrar antes da cauda e não pode haver bolhas de ar. Retire solução suficiente para que haja cerca de dois centímetros de agarose acima do embrião e 1 centímetro de agarose abaixo dele.
Desenhe um embrião em cada capilar antes de prosseguir. Esta etapa requer alguma prática para dominar. Prepare-se para isso usando embriões não valiosos.
Quando a agarose solidificar completamente, armazene as amostras em meio E3, apoiando os capilares em uma parede de béquer com plasticina, com a abertura inferior em solução. Agora, monte o porta-amostras. Primeiro, insira duas mangas de plástico do tamanho certo uma contra a outra na haste.
As fendas nas mangas devem estar voltadas para fora. Em seguida, prenda um parafuso de fixação e insira o capilar através do suporte, até que a faixa preta fique visível do outro lado. Evite tocar no êmbolo.
Em seguida, aperte o parafuso de fixação. Em seguida, empurre um centímetro de agarose para fora do capilar e corte-o. Em seguida, insira a haste no disco porta-amostras.
Antes de carregar o disco de amostra, verifique se o stage está na posição superior no software de controle. Em seguida, use trilhos de guia para deslizar o suporte e a amostra para o microscópio. Agora, crie uma imagem da amostra escolhida conforme descrito no protocolo de texto.

light-sheet-microscopy-sample-preparation-mounting-live-zebrafish

Research

JoVE Encyclopedia of Experiments

Biology

Danio rerio (zebrafish)

Embryo

Light Sheet Microscopy Sample Preparation: Mounting Live Zebrafish Embryos for Long-Term Imaging

3.2K visualizações. - Primeiro, prepare a agarose adicionando meio E3, que fornece cálcio aos embriões descorionados para a agarose derretida. Em seguida, adicione MS222 para anestesiar embriões. Resfrie a mistura de agarose a 38 graus Celsius, perto de solidificar. Selecione alguns embriões descorionados que expressam proteínas fluorescentes e transfira-os para a mistura de agarose. Em seguida, insira totalmente um êmbolo em um capilar de vidro e retire um embrião, certificando-se de que ele entre...

Preparação de amostras de microscopia de folha de luz: montagem de embriões vivos de peixe-zebra para imagens de longo prazo

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Name	Company	Catalog Number	Comments
Microscópio Lightsheet Z.1	Microscopia Carl Zeiss
Baixo ponto de fusão de agarose	Roth	Nº 6351.1
Baixo ponto de fusão de agarose	sigma	A4018 ou A9414
3-aminobenzoato de etilo metanossulfonato (MESAB/MS-222/Tricaína)	sigma	E10521
20 μl (1 mm de diâmetro interno, marcado em preto) capilares	marca	701904	Vendido como peça de reposição para TransferPettor
Êmbolos de ponta de teflon para capilares de 20 μl	marca	701932	Vendido como peça de reposição para TransferPettor