Preparação de amostras de microscopia de folha de luz: montagem de embriões vivos de peixe-zebra para imagens de longo prazo

Resumo

Fonte: Icha J., et al. Usando microscopia de fluorescência de folha de luz para obter imagens do desenvolvimento do olho do peixe-zebra. J. Vis. Exp. (2016).

Este artigo descreve a preparação de amostras para microscopia de fluorescência de folha de luz. Ele também demonstra um método para montar embriões vivos de peixe-zebra para imagens de longo prazo, o que permite a gravação de filmes de longo lapso de tempo de embriões vivos em condições quase fisiológicas.

Protocolo

1. Preparação da amostra

1. Preparando a mistura de agarose
   1. 15 minutos antes de fazer a mistura de agarose, derreta uma alíquota de 1 ml de agarose de baixo ponto de fusão a 1% (dissolvida em meio E3) em um bloco de aquecimento regulado para 70 °C. Quando a agarose estiver completamente fundida, transfira 600 μl para um tubo novo de 1,5 ml, adicione 250 μl de meio E3, 50 μl de 0,4% MS-222 e 25 μl de solução de estoque de grânulos em vórtice.
      nota: Isso perfaz 925 μl da mistura, enquanto 75 μl adicionais são calculados para o líquido adicionado posteriormente junto com os embriões.
   2. Mantenha o tubo em um segundo bloco de aquecimento a 38-40 °C ou certifique-se de que a agarose esteja muito próxima de seu ponto de gelificação antes de colocar embriões de amostra nele.
2. Montando os embriões
   1. Pegue cinco capilares de vidro de 20 μl de volume (com uma marca preta, ~ 1 mm de diâmetro interno) e insira os êmbolos de ponta de Teflon correspondentes neles. Empurre o êmbolo através do capilar para que a ponta de Teflon fique na parte inferior do capilar.
   2. Transfira cinco embriões (um número que pode ser montado de uma só vez) com uma pipeta de vidro ou plástico para o tubo de mistura de agarose quente a 37 °C em vórtice.
      nota: Tente transportar um volume mínimo de líquido junto com os embriões.
   3. Insira o capilar na mistura e sugue um embrião para dentro, puxando o êmbolo para cima. Certifique-se de que a cabeça do embrião entre no capilar antes da cauda. Evite bolhas de ar entre o êmbolo e a amostra. Deve haver ±2 cm de agarose acima do embrião e ±1 cm abaixo dele. Repita para os embriões restantes.
   4. Aguarde até que a agarose solidifique completamente, o que acontece em poucos minutos e depois guarde as amostras em meio E3, colando-as na parede de um béquer com plasticina ou fita adesiva. A abertura inferior do capilar deve estar pendurada livre na solução, permitindo a troca gasosa para a amostra.
      NOTA: Um protocolo semelhante às seções 1.1 e 1.2 também pode ser encontrado na página wiki do OpenSPIM http://openspim.org/Zebrafish_embryo_sample_preparation.

2. Posicionamento da amostra

1. Conjunto de suporte de amostra
   1. Insira 2 mangas de plástico do tamanho certo (pretas) uma contra a outra na haste do porta-amostras. Seus lados de fenda devem estar voltados para fora. Prenda o parafuso de fixação frouxamente girando-o 2-3 rodadas. Insira o capilar através do clamp parafuso e empurre-o através do suporte até que a faixa preta fique visível do outro lado. Evite tocar no êmbolo.
   2. Aperte o parafuso de fixação. Empurre o excesso de 1 cm de agarose abaixo do embrião para fora do capilar e corte-o. Insira a haste no sample disco porta-amostras.
   3. Confirme no software se a platina do microscópio está na posição de carga. Use trilhos de guia para deslizar todo o suporte com a amostra verticalmente para baixo no microscópio. Gire-o para que o disco suporte magnético trave na posição.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Microscópio Lightsheet Z.1	Microscopia Carl Zeiss
Baixo ponto de fusão de agarose	Roth	Nº 6351.1
Baixo ponto de fusão de agarose	sigma	A4018 ou A9414
3-aminobenzoato de etilo metanossulfonato (MESAB/MS-222/Tricaína)	sigma	E10521
20 μl (1 mm de diâmetro interno, marcado em preto) capilares	marca	701904	Vendido como peça de reposição para TransferPettor
Êmbolos de ponta de teflon para capilares de 20 μl	marca	701932	Vendido como peça de reposição para TransferPettor