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1. Preparação de embriões
- Após o acasalamento, colha os embriões em E3 em uma placa de Petri e incube-os a 26,5 ° C por cerca de 28 h antes da montagem.
nota: Isso retarda o desenvolvimento dos embriões, de modo que os embriões estão aproximadamente no estágio 30 de somito no início da imagem.
- Anestesiar embriões em 0,016-0,020% de Tricaína em E3. Para inibir a pigmentação, adicione PTU a uma concentração de 200 μM.
- Descorione os embriões usando fórceps sob um microscópio de dissecação. Usando duas pinças, segure e separe suavemente o córion para liberar o embrião.
2. Montagem em agarose
NOTA: O método de montagem desenvolvido requer duas concentrações diferentes de agarose de baixo ponto de fusão em E3 com 0,02% de tricaína e PTU, conforme necessário. A primeira solução de agarose contém uma concentração ideal de agarose na qual a distorção e a motilidade são mínimas. A otimização é descrita na etapa 5 abaixo.
- Aquecer as soluções de agarose para as duas camadas (concentração definida no passo 5 abaixo e 1%) a 65 °C. Deixe a agarose esfriar até aproximadamente 30 ° C imediatamente antes da montagem, para que o embrião não seja prejudicado pelo calor. Para a montagem, use pratos com fundo de vidro de 35 mm com fundo de vidro de cobertura nº 0. A lamínula fixada no fundo do prato cria um poço raso de 10 mm (aprox. 1,2 mm de profundidade), no qual o embrião deve ser colocado.
nota: Neste caso, a concentração com menor motilidade e distorções ficou entre 0,025 a 0,040% de agarose.
- Coloque delicadamente um embrião descorionado com um de seus lados laterais voltado para o fundo do prato usando uma pipeta de vidro ou micropipeta. Se estiver usando uma micropipeta, corte a parte externa da ponta para aumentar o tamanho da abertura para caber no embrião (Figura 1A). Remova cuidadosamente qualquer E3 restante com uma micropipeta.
- Adicione a primeira solução de agarose ao pequeno poço criado pela lamínula presa ao fundo do prato para cobrir o embrião (Camada 1) (Figura 1B). Certifique-se de que a agarose cubra o poço pequeno, mas não o transborde.
- Cubra o pequeno poço com uma lamínula (22 mm x 22 mm) (Figura 1C) para criar um espaço estreito preenchido com agarose com o embrião entre as duas lamínulas.
- Coloque uma camada de solução de agarose a 1% em cima da lamínula em todo o fundo do prato (Camada 2) (Figura 1D). À medida que essa camada se solidifica, ela mantém a lamínula no lugar.
- Encha a porção restante do prato com E3 contendo 0,02% de Tricaína para manter o sistema hidratado (Camada 3) (Figura 1E).
nota: Nesta configuração, a lamínula e a agarose a 1% protegem a camada inferior de se diluir.
3. Otimização da solução de agarose para a camada 1
- Para identificar a concentração ideal de agarose para a Camada 1, use uma abordagem de pesquisa em grade multiescala. Monte embriões em concentrações crescentes de agarose variando de 0,01% a 1%, seguidas de imagens de lapso de tempo de restrição de crescimento embrionário e motilidade no campo de visão. Identifique as concentrações em que a distorção e a motilidade são mínimas.
- Para otimizar ainda mais a concentração de agarose, monte os embriões usando uma faixa mais fina de concentrações de agarose (por exemplo, entre 0,025 e 0,040% de agarose), dependendo da concentração considerada melhor na etapa 3.1 (por exemplo, 0,025%, 0,028%, 0,031%, etc.).
nota: Em nosso laboratório, a concentração ótima de agarose foi em torno de 0,03%.
