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1. Configuração do microscópio, aquisição, processamento e análise de imagens
- Prepare agarose de baixo ponto de fusão (LMP) a 0,8%: Adicione 0,8 g de agarose LMP a 100 ml de E3 e aqueça até dissolver totalmente. Enquanto estiver quente, alíquota de 1 ml de agarose LMP em tubos de microcentrífugas de 1,5 ml em um bloco de aquecimento a 37 °C. A agarose LMP permanecerá fundida a 37 ° C. Adicione 40 μl de 4 mg / ml (25x), pH 7,0 de tricaína a cada alíquota de 1 ml de agarose LMP a 37 ° C. NOTA: Se estiver trabalhando com uma cepa pigmentada, adicione 20 μl de PTU a 0,15% (50x) a cada alíquota de 1 ml.
- Conservar a restante agarose LMP durante vários meses em tubos selados de 50 ml a 4 °C.
- Anestesiar embriões parabióticos a serem visualizados adicionando 1 ml de 4 mg/ml (25x), pH 7,0 tricaína aos 25 ml de E3 em que os embriões já estão.
- Gire suavemente o prato para que os embriões se acumulem no meio. Em seguida, usando uma pipeta de transferência de plástico de ponta larga, retire os embriões com o mínimo de líquido possível. Vire a pipeta na vertical e salte suavemente os embriões para que eles se acomodem no fundo da pipeta.
- Com os embriões no fundo da pipeta, transfira-os para uma alíquota de 1 ml de alorose LMP, tocando levemente a ponta da pipeta na superfície da agarose. Evite transferir o excesso de líquido, pois isso diluirá a agarose.
- Depois de expelir o excesso de líquido da pipeta, use a pipeta para misturar suavemente os embriões dentro da agarose e, em seguida, use a pipeta para transferir toda a agarose e embriões para o poço de uma lamínula com fundo de vidro (lamínula nº 1,5), placa de 6 poços.
nota: Certifique-se de descartar a pipeta após transferir os embriões para a placa de imagem. A agarose residual se depositará dentro da pipeta, tornando-a ineficaz para uso posterior. Em vez disso, use uma nova pipeta a cada vez.
- Sob um estereoscópio, use uma ponta de pipeta de carregamento de gel fixada na extremidade de uma agulha de provocação com cabo de madeira para posicionar os embriões em direção à lamínula (para garantir que estejam dentro da distância de trabalho da objetiva do microscópio) e na orientação desejada para a geração de imagens.
nota: Reposicione continuamente até que a agarose esteja totalmente firme. Tome cuidado para montar os embriões parabióticos de acordo com o embrião do par a ser visualizado. Dada a orientação aleatória dos embriões conjuntos, para alguns pares pode ser difícil obter imagens de ambos os embriões. Nesse cenário, recupere os embriões da agarose usando uma pinça e uma pipeta de transferência de plástico de ponta larga e, em seguida, remonte para obter imagens de uma perspectiva diferente.
- Assim que a agarose endurecer, cubra com 2 a 3 ml de E3 suplementado com tricaína (e PTU, se necessário).
- Visualize os embriões usando um microscópio confocal de epifluorescência de campo amplo invertido, confocal de varredura a laser ou disco giratório. Selecione a objetiva mais apropriada para a imagem desejada. Para um campo de visão de embrião inteiro, use uma objetiva 4x. Selecione uma ampliação maior, como uma objetiva de 20x, para criar uma imagem de um tecido específico
nota: Se estiver usando um microscópio vertical, monte em agarose LMP (semelhante a acima) em uma lamínula de vidro. Inverta a lamínula de vidro em uma lâmina de microscópio de vidro que tenha um anel de graxa a vácuo preenchido com o mesmo E3-tricaine-PTU.
- Processe imagens adquiridas usando pacotes de software de análise de imagem gratuitos, como NIH Image J/FIJI.
nota: Conte o número de células e quantifique dinâmicas, como migração e divisão celular, usando algoritmos de segmentação e rastreamento.