1: Axotomia de dois fótons usando um microscópio de dois fótons personalizado com um laser Chameleon Ti-Sapphire
- Prepare-se para a imagem. Coloque o(s) embrião(ões) montado(s) em um porta-lâminas sob o microscópio. Concentre-se em um embrião com uma objetiva de água de 40X (0,8 NA). Ligue o laser. Conseguimos visualizar e danificar de forma reprodutível os neurônios que expressam GFP usando os seguintes parâmetros. Para visualizar axônios com uma potência não prejudicial, defina o laser para um comprimento de onda de 910 nanômetros (nm) e uma potência de 30 miliwatts (mW listados são a quantidade de potência na amostra). Abra o software de imagem. Usamos o software ScanImage desenvolvido no laboratório de Karel Svoboda.
- Pressione o foco para escanear o embrião com o laser de dois fótons, localize o axônio que deseja axotomizar e capture uma imagem desse axônio. Marque a primeira e a última posição Z, adquira a imagem e faça uma projeção máxima das pilhas Z.
- Aumente o zoom em 70X no ramo do axônio que você deseja axotomizar e pare a varredura. Aumente o mW na amostra para a potência prejudicial de 180 mW e execute uma única varredura com o laser. Fazemos isso definindo o número de fatias Z para 1 e pressionando "Agarrar". Isso deve ser suficiente para cortar o axônio. Consulte a discussão sobre métodos para otimizar esse procedimento para seu microscópio e objetivo experimental.
- Diminua o zoom, reduza a potência para 30 mW e tire uma imagem.
2: Axotomia de dois fótons em microscópio confocal/de dois fótons Zeiss 510
- Coloque o embrião montado no palco e coloque-o em foco usando uma objetiva de água 25X ou outra objetiva adequada.
- Ligue os lasers de dois fótons (910 nm) e argônio (488 nm) em uma configuração de várias faixas para que seja possível alternar de um para o outro. Embora ambos os lasers sejam usados para detectar GFP, a emissão de dois fótons é visualizada em vermelho e a emissão de laser de argônio em verde para diferenciar os dois.
- Use o laser de argônio para identificar um axônio para ferir. Em Configurações Z, marque a primeira e a última seções ópticas. Pegue uma imagem confocal e crie uma projeção máxima da pilha Z.
- Escolha a região do axônio a ser lesionada e coloque essa região em foco. Desligue o laser de argônio e ligue o laser de dois fótons. Escaneie a amostra com os dois fótons a uma intensidade de laser de ~ 9% de transmissão para garantir que o axônio ainda esteja em foco.
- Clique no botão "parar" para que a ferramenta de corte esteja disponível. Use o corte para ampliar a área de interesse. Normalmente, ampliamos para ~ 70X (o zoom pode ser verificado na guia "modo"). Na guia "canais", altere a intensidade dos dois fótons de ~ 9% de transmissão para 15-20% de transmissão.
- Para cortar um axônio, ative o botão "fast XY" por cerca de 1 segundo e, em seguida, pressione o botão de parada para evitar danos excessivos. O axônio deve ser visto como detritos espalhados se o procedimento funcionar.
- Para garantir que o axônio foi danificado, volte para o laser de argônio de 488 nm, tire outra imagem confocal e crie uma projeção máxima.