$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Monte larvas para experimentos de comportamento
- Faça 1,5% de agarose de baixo ponto de fusão em ddH2O e armazene em um bloco de calor de 42 ° C para evitar que solidifique.
- Usando uma pipeta Pasteur de vidro, transfira uma das larvas pré-selecionadas para um tubo de agarose de baixo ponto de fusão a 1,5% com o mínimo possível de água azul/embrião.
- Transfira as larvas em uma gota de agarose para uma pequena placa de Petri.
- Sob um microscópio de dissecação, posicione a larva dorsal para cima.
- Quando a agarose solidificar, corte a agarose com uma lâmina de barbear fina (bisturi # 11), deixando uma fatia de ágar ao redor de toda a larva.
- Faça dois cortes diagonais de cada lado da gema; tome cuidado para não cortar a larva.
- Encha a área ao redor da agarose com embrião/água azul.
- Afaste a agarose do tronco e da cauda da larva (Figura 1).
2 . Prepare o software de câmera e imagem de alta velocidade
- Monte a câmera de alta velocidade no escopo de dissecação.
- Conecte a câmera ao computador.
- Ligue o computador.
- Ligue a câmera de alta velocidade.
- Abra o software de vídeo/imagem (usamos o software de imagem AOS e descreveremos os procedimentos para usá-lo aqui, mas outro software de imagem é igualmente aceitável).
- Ajuste as configurações da câmera de acordo (ou seja, 1.000 quadros por segundo (fps), buffer de disparo de 50% ou outras configurações preferidas).
- Comece a gravar.
3. Ative neurônios individuais usando um laser de 473 nm
- Conecte o estimulador, o laser e o cabo óptico.
- Ligue o estimulador.
- Defina o estimulador para um máximo de 5 Volts e uma duração de pulso de 5 mseg.
- Ligue o laser de acordo com as instruções do fabricante.
- Use um microscópio de dissecação para posicionar a ponta do cabo óptico próximo ao corpo celular de um neurônio com expressão ChEF-tdTomato (Figura 1).
- Forneça pulso de luz azul para ativar o neurônio sensorial.
- Registre o comportamento usando uma câmera de alta velocidade definida em 500 ou 1.000 quadros por segundo.
- Repita o experimento conforme desejado, esperando 1 minuto entre cada ativação para evitar a habituação. (Registramos um mínimo de três respostas para cada neurônio).
- Para liberar as larvas, separe a agarose com uma pinça, tomando cuidado para não ferir o animal. Este animal pode se desenvolver ainda mais e o procedimento pode ser repetido em um estágio mais antigo para caracterizar o desenvolvimento do comportamento. O embrião também pode ser remontado para imagens confocais de alta resolução da célula ativada para correlacionar o comportamento com a estrutura celular, conforme descrito abaixo.
- Transfira a larva para a placa de cultura com água fresca azul / embrião. Usamos uma placa de 24 poços para acompanhar as larvas individuais.
