Dissecção da lente do olho: uma técnica para observar a morfologia da lente do peixe-zebra

Neste artigo

Resumo

Fonte: Vorontsova I. et al, Avaliação da localização do núcleo do cristalino do peixe-zebra e integridade sutural. J. Vis. Exp. (2019).

Este vídeo descreve o protocolo desenvolvido para dissecar lentes de peixe-zebra adultas e larvais para analisar a morfologia cortical da lente e a integridade estrutural das suturas da lente.

Protocolo

1. Dissecção de lentes de peixe-zebra larval e adulto

Anestesie peixes de larvas de 6 dpf até a idade adulta com tricaína até que não respondam ao toque, mas ainda mostrem batimentos cardíacos fortes. Meça o comprimento padrão do peixe de acordo com Schilling (2002) para estadiamento.
Extirpar imediatamente os olhos usando uma tesoura de microdissecção e colocá-los em uma placa de dissecção em PBS (Figura 1 mostrada para olhos adultos).
1. Faça um prato personalizado de 35 mm preenchido com silicone para dissecções de lentes. Uma vez que o silicone tenha endurecido, excise um divot com cerca de 2-3 mm de diâmetro e 0,5 mm de profundidade para imobilizar os olhos/lentes adultos durante a dissecção.
Dissecção de lentes de peixe-zebra adulto
1. Coloque um olho adulto no prato com o lado posterior voltado para cima preenchido com PBS. Imobilize o olho inserindo uma pinça em um ângulo de <45° através do disco óptico. Tenha cuidado para não cortar ou comprimir a lente. Faça duas ou três incisões radiais através da retina e esclera do disco óptico até a zona ciliar com uma tesoura de dissecção.
2. Descasque a retina e a esclera como pétalas de flores e inverta o olho, com a córnea voltada para cima. Imobilize o cristalino indiretamente por meio da manipulação da esclera e da córnea com o lado plano da tesoura, enquanto puxa a retina e os tecidos anexados com uma pinça. Corte cuidadosamente o excesso de tecido da lente.
  nota: É vital dissecar cuidadosamente para obter lentes consistentemente saudáveis.
Dissecção de lentes larvais de peixe-zebra
1. Coloque um lado posterior do olho larval para cima na parte plana do prato de silicone preenchido com PBS e use uma agulha de tungstênio afiada para fazer cortes radiais na retina e na esclera enquanto imobiliza o olho com outra agulha ou pinça de tungstênio.
  nota: Tenha cuidado para não danificar a lente.
  1. Afie a ponta de um fio de tungstênio de 2 cm de comprimento de 0,1 mm eletroliticamente, suspendendo a ponta do fio em NaOH a 10% (p / v) e aplicando uma corrente alternada de baixa tensão 14 . Prenda a agulha em uma pipeta Pasteur derretendo a extremidade de vidro usando um bico de Bunsen.
    nota: Ferramentas alternativas de dissecção fina também podem ser usadas.
    cuidado: NaOH é corrosivo.
2. Retire suavemente a lente do olho dissociado com um lado cego da agulha e retire cuidadosamente o tecido anexado.

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Resultados

Imagens de microscópio de dissecção olho de peixe; vistas anterior/posterior, remoção da lente, barras de escala de 2 mm.
Figura 1: Dissecção da lente do peixe-zebra. (A) Os olhos são dissecados de peixes anestesiados e colocados com o lado posterior para cima (B). (C) Os olhos são imobilizados por fórceps através do disco óptico (od) e duas a três incisões radiais são feitas ...