Eletrofisiologia de grampo de remendo de células inteiras: um método para estudar as propriedades elétricas dos neurônios

Resumo

Fonte: Roy, B., et al. Gravações de grampos de patch de células embrionárias de Mauthner de peixe-zebra. J. Vis. Exp. (2013).

Este protocolo descreve uma técnica chamada eletrofisiologia de patch clamp de célula inteira, que é um método para estudar propriedades elétricas de neurônios de Mauthner e outras células reticuloespinhais em embriões de peixe-zebra.

Protocolo

1. Gravação de grampo de patch (modo de célula inteira)

1. Todas as gravações são realizadas no modo patch clamp de célula inteira. As câmaras de gravação são colocadas em uma platina de microscópio em uma configuração de eletrofisiologia. Nossos estágios são fixos e o microscópio vertical da braçadeira do remendo é aparafusado a uma plataforma móvel do microscópio ou a um tradutor do microscópio.
2. As pipetas de patch clamp são puxadas em um extrator horizontal (P-97; Instrumentos Sutter Co.) de vidro borossilicato de paredes finas obtido a partir de WPI. Os diâmetros da ponta da pipeta são da ordem de 0,2-0,4 μm após o polimento a fogo para uma borda lisa, e o cone da haste tem ~ 4 mm de comprimento.
3. Conecte a pipeta ao amplificador head-stage na configuração de eletrofisiologia. É importante manter o head-stage em um ângulo de aproximadamente 45° em relação ao eixo horizontal, pois isso garante um ângulo de entrada para a pipeta adequado para a formação de vedações de alta resistência na célula de Mauthner.
4. Pouco antes de entrar na solução do banho, aplique uma pequena quantidade de pressão positiva na pipeta para reduzir a chance de sujar a ponta. Ao registrar mEPSCs, as soluções de banho incluem 1 μM de TTX para bloquear os potenciais de ação, 5 μM de estricnina para bloquear os receptores de glicina e 10 μM de bicuculina ou 100 μM de picrotoxina para bloquear os receptores GABAA. Ao registrar mIPSCs, as soluções de banho incluem 1 μM de TTX, ácido quinurênico e bicuculina ou estricnina, dependendo da atividade do receptor de interesse.
5. Aproxime-se da célula M com uma pequena quantidade de pressão positiva na pipeta. A pressão positiva empurra suavemente a célula de um lado para o outro e, quando posicionada imediatamente sobre a célula, forma uma pequena covinha na membrana celular. Deixe a pipeta no lugar por alguns segundos para limpar suavemente a superfície da célula para que uma vedação forte entre a pipeta e a membrana possa ser formada. A liberação da pressão positiva na pipeta permite que a vedação seja iniciada e uma pequena quantidade de pressão negativa juntamente com potenciais negativos da pipeta resulta na formação de vedações GigaΩ em poucos segundos.
6. Altere o potencial de retenção no amplificador para -60 mV. Rompa a membrana celular com uma série de pulsos curtos de sucção. Registre imediatamente os potenciais de membrana e minimize os artefatos de capacitância. Compense a capacitância da célula (Cm) e a resistência de acesso (série) (Ra) em 70-85%. A Ra deve ser monitorada rotineiramente, a cada 30 segundos a um minuto, e se houver uma mudança de 20% ou mais, abortar o experimento.
7. Uma vez que o experimento tenha terminado e dados suficientes tenham sido adquiridos, a preparação é sacrificada removendo o rombencéfalo com um par de fórceps. Neste ponto, a análise de dados pode começar.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Extrator de pipetas	Sutter Instruments Co	Pág. 97
Microscópio vertical da braçadeira do remendo	Leica Microsystems	DMLFSA
amplificador	Dispositivos Moleculares	200B
Micromanipulador	Siskiyou Inc.	MX7500