Injeção intramuscular (IM): entrega composta no músculo dorsal de um peixe-zebra adulto

Resumo

Fonte: Myllymäki, H., et al. Imunização de peixe-zebra adulto para a triagem pré-clínica de vacinas baseadas em DNA. J. Vis. Exp. (2018).

Este vídeo descreve a técnica de injeção intramuscular para administrar compostos nos músculos dorsais de um peixe-zebra adulto.

Protocolo

1. Injeção da vacina de DNA e eletroporação

1. Para imunizações de acordo com este protocolo, use peixe-zebra adulto saudável de 6 a 12 meses. Manter os peixes em sistema de escoamento com ciclo claro/escuro de 14/10 h, com um máximo de sete peixes por 1 L de água.
2. Prepare uma solução de éster etílico (tricaína) de ácido 3-aminobenzóico a 0,02% (pH 7) em água do tanque para anestesiar os peixes. Use uma placa de Petri de 10 cm ou algo semelhante.
3. Prepare um tanque de recuperação enchendo um copo de 5 L com 3 L de água limpa do sistema.
4. Prepare um acolchoamento de vacinação para manter os peixes em uma posição fixa durante a vacinação. Pegue um pedaço de esponja de 5 x 7 cm² de uma esponja de 2 a 3 cm de espessura. Corte uma ranhura na esponja com uma lâmina de bisturi ou uma tesoura afiada.
   nota: O mesmo preenchimento de vacinação pode ser usado em vários experimentos. Desinfete a esponja entre os experimentos, mergulhando-a em álcool etílico a 70% e deixe secar.
5. Mergulhe bem a esponja na água do sistema e coloque-a em uma placa de Petri.
6. Jejue o peixe 24 horas antes das vacinas.
7. Anestesie um peixe-zebra colocando-o em uma placa de Petri contendo 0,02% de tricaína. Espere até que o peixe não responda à estimulação do toque e até que não haja movimento das brânquias. Anestesie um único peixe de cada vez.
8. Usando uma colher de plástico, transfira o peixe-zebra anestesiado para a esponja úmida e coloque o lado ventral do peixe para baixo no sulco. Na posição correta, certifique-se de que a cabeça e a maior parte do corpo do peixe estejam dentro do sulco e que a barbatana dorsal e a cauda estejam salientes para fora do sulco.
9. Sob o microscópio, coloque cuidadosamente a agulha em um ângulo de aproximadamente 45° próximo ao músculo dorsal do peixe-zebra, usando as rodas de ajuste fino dos eixos x e y no micromanipulador.
10. Encontre o pequeno ponto sem escamas na frente da barbatana dorsal, onde empurrar a agulha não exige força. Se houver resistência, tente um local adjacente. Evite ferir a coluna, a barbatana dorsal ou as escamas.
    nota: Se a agulha dobrar enquanto empurra, encurte ligeiramente a agulha cortando-a.
11. Use o pedal para injetar gradualmente a solução da vacina no músculo. Observe a injeção através do microscópio: o vermelho de fenol é visível ao entrar no tecido muscular. Ajuste a duração do pulso, se necessário.
    nota: Como alternativa, use o botão iniciador de pulso no painel frontal da bomba pneumática para a injeção. No entanto, o uso de um pedal remoto permite usar a outra mão para ajustar o comprimento do pulso pela roda de discagem de 10 voltas. Evite injetar a solução muito rápido, pois isso pode causar danos excessivos aos tecidos. Certifique-se de não injetar ar.
12. Eletroporar o peixe imediatamente após a injeção. Certifique-se de que o peixe ainda esteja sob anestesia. Mantenha o peixe na esponja e coloque-o entre os eléctrodos do tipo pinça, de modo a que os eléctrodos fiquem localizados em cada lado do local de injecção. Não pressione as pinças do eletrodo com muita força, mas mantenha os dois eletrodos em contato com o peixe.
    1. Pressione o botão de partida no eletroporador para fornecer seis pulsos de 40 V, 50 ms.
    2. Transfira suavemente o peixe para o tanque de recuperação.
    3. Limpe os eletrodos após cada eletroporação, passando-os com etanol 70%.
       nota: Monitore cuidadosamente o bem-estar dos peixes após a vacinação. Eutanásia de qualquer peixe que mostre sinais de desconforto (recuperação lenta da anestesia, natação aberrante, respiração ofegante) em tricaína a 0,04%. Após a recuperação, transfira o peixe para a unidade de fluxo e alimente-o normalmente.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Sal de sódio vermelho de fenol	Sigma-Aldrich	114537-5G
Tricaína (sal de metanossulfonato de 3-aminobenzoato de etilo)	sigma	A5040-100g	Solução de anestesia e eutanásia
Kits de eletrodos de pinça (7 mm)	Aparelho BTX Harvard	BTX 450165	Eletrodos tipo pinça
Capilares de aluminossilicato	Aparelho de Harvard	Telefone: 30-0108
Micromanipulador	Narishige	MA-153
microscópio	Olimpo	ZS61
ECM Electro Porator Quadrado	Aparelho BTX Harvard	BTX ECM 830
Colher de plástico
esponja
Bancada de isopor