Microinjeção de embriões: uma técnica para entregar um composto na gema do peixe-zebra

Resumo

Fonte: Sorlien, E. L., et al. Produção e identificação eficientes de nocautes genéticos gerados por CRISPR/Cas9 no sistema modelo Danio rerio. J. Vis. Exp. (2018).

Este vídeo descreve uma técnica de microinjeção de embriões para entregar compostos no saco vitelino de peixe-zebra.

Protocolo

1. Microinjeção de componentes CRISPR em embriões de peixe-zebra

1. Configure tanques de reprodução na noite anterior à injeção, colocando o número de machos e fêmeas desejados (normalmente 2 fêmeas e 1 ou 2 machos) em um tanque de reprodução com uma divisória no lugar.
2. Prepare uma placa de microinjeção com 1,5% de agarose em 1x meio E3 (ver Tabela de Materiais) com 0,01% de azul de metileno (um fungicida) despejando 35 mL de agarose derretida em uma placa de Petri de 10 cm e coloque suavemente um molde de plástico para criar calhas em forma de cunha na solução, batendo no molde para eliminar bolhas de ar.
3. Deixar endurecer a agarose e conservar a cápsula com uma pequena quantidade de suporte e envolvida em película de parafina para evitar que a placa seque a 4 °C.
   nota: As placas de injeção são reutilizáveis por várias semanas, até que os poços se deformem ou sequem, ou a placa comece a desenvolver mofo.
4. Na manhã da injeção, descongele o sgRNA purificado e a proteína Cas9 no gelo. Lembre-se de manusear todos os materiais com luvas para evitar a contaminação por RNase e de usar pontas e tubos sem RNase.
5. Gere uma solução injetável de 5 μL combinando a proteína Cas9 e o sgRNA em uma proporção de 2:1 de Cas9:sgRNA para obter concentrações finais de 400 pg/nL de proteína Cas9 e 200 pg/nL de sgRNA. Incube a solução de Cas9 / sgRNA em temperatura ambiente por 5 min para permitir que o Cas9 e o sgRNA formem um complexo de ribonucleoproteína. Adicione 0,5 μL de solução de vermelho de fenol a 2,5% em peso/vol (consulte a Tabela de Materiais) e água livre de RNase até um volume final de 5 μL.
   nota: A força iônica da solução demonstrou afetar a solubilidade do complexo Cas9 / sgRNA, portanto, a adição de KCl pode aumentar a eficiência de corte de sgRNAs que exibem baixa formação de indel.
6. Faça uma agulha de injeção puxando um capilar de vidro de 1,0 mm usando um extrator de micropipeta. Corte a ponta da agulha recém-feita usando uma nova lâmina de barbear ou fórceps para obter uma abertura angular que perfure facilmente o córion e o saco vitelino.
7. Coloque a agulha em um micromanipulador conectado a um microinjetor com a fonte de ar ligada. Sob um microscópio óptico usando a ampliação adequada para a calibração determinada para o aparelho específico, ajuste a pressão de injeção até que a agulha ejete consistentemente uma solução de 1 nL em uma placa de Petri cheia de óleo mineral.
   nota: A qualidade da agulha é crítica. Pratique a produção de uma agulha e a injeção no saco vitelino dos embriões até que essa habilidade seja dominada antes de tentar novos experimentos.
8. Remova a divisória e deixe os peixes se reproduzirem por aproximadamente 15 min.
   nota: Tempos de reprodução mais longos produzirão mais embriões, no entanto, a injeção deve ser concluída enquanto os embriões estão no estágio de 1 célula para maximizar a chance de que o corte de Cas9 ocorra precocemente e, portanto, diminua o mosaicismo genético. Os embriões podem ser injetados em estágios posteriores (2 a 4 estágios celulares), mas isso pode diminuir a taxa de transmissão da linha germinativa do alelo modificado.
9. Colete os ovos usando uma peneira e enxágue-os em uma placa de Petri de 10 cm usando 1x meio E3 com azul de metileno a 0,0001%. Examine a saúde dos ovos ao microscópio óptico, removendo quaisquer ovos não fertilizados e detritos.
10. Separe de 10 a 15 embriões como controle não injetado em uma placa de Petri separada e rotulada.
11. Usando uma pipeta de transferência, alinhe suavemente os ovos na placa de injeção aquecida à temperatura ambiente.
12. Sob um microscópio de dissecção com aumento de 2,5X, injetar 1 nL da solução no saco vitelino de cada embrião para injetar um total de 400 pg de proteína Cas9 e 200 pg de sgRNA.
    nota: Para aumentar o corte, se desejado ou necessário, aumente a concentração final da proteína Cas9 para 800 pg/nL e de sgRNA para 400 pg/nL na solução injetável; no entanto, isso também pode aumentar o corte fora do alvo e/ou diminuir a saúde do embrião. A eficiência de corte também pode ser aumentada injetando diretamente na célula. No entanto, a injeção no saco vitelino é tecnicamente menos exigente e dá corte suficiente para produzir peixes com alta transmissão germinativa (>70% da prole contendo um alelo modificado).
13. Retorne os embriões injetados para uma placa de Petri devidamente rotulada, cubra-os com 1x meio E3 com azul de metileno e coloque-os em uma incubadora de embriões ajustada para 28 °C.
14. 24 h após a fertilização (hpf), inspecione a saúde dos embriões injetados, removendo indivíduos mortos ou com desenvolvimento anormal e troque o meio (ver Figura 1). Verifique a taxa de sobrevida contra o controle não injetado.
    nota: Ao direcionar um gene não essencial, espera-se menos de 10% de letalidade em relação ao controle não injetado. Se forem observados níveis elevados de letalidade nas populações injetadas em guia em comparação com o controle não injetado, isso pode indicar que o gene alvo é essencial para o desenvolvimento ou que os efeitos fora do alvo estão levando ao fracasso do desenvolvimento. Pode ser necessário reduzir a quantidade de reagentes CRISPR injetados ou pode ser necessária a geração de um novo sgRNA com efeitos fora do alvo reduzidos.
15. Devolva os embriões à incubadora e continue crescendo os embriões para 72 hpf, trocando o meio diariamente para manter a saúde do embrião.

Resultados

Figura 1: Comparação da saúde de 24 embriões injetados hpf. Um embrião vivo (A) desenvolvido a 24 hpf, é facilmente distinguido de um embrião que abortou o desenvolvimento (B). Embriões que se assemelham a (B) ou têm características drasticamente alteradas para (A), como curvatura da coluna vertebral ou desenvolvimento alterado da cabeça e dos olhos, devem ser removidos do prato

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Água livre de RNase	Qualquer marca		Síntese de RNAs guia. Thermo Fisher e Qiagen carregam água adequada.
Meios de embriões E3	Feito em casa		Meios para criação de embriões e fazendo injeciton plate. Receita: http://cshprotocols.cshlp.org/ content/2011/10/pdb.rec66449
Azul de metileno	Sigma-Aldrich	M9140	Adicionado a 1x meio E3 para prevenir o crescimento de fungos em embriões.
Placa de Petri	Thermo Fisher	FB0875711Z	Armazenar embriões de fundição em placa de injecção
agarose	Denville	CA3510-8	Placa de injeção de fundição, géis de agarose.
Molde de microinection	Ferramentas científicas adaptativas	TU-1	Para criar poços para conter embriões durante a injeção
Vermelho de fenol	Sigma-Aldrich	Pág. 0290	Corante para visualização de injeção
Óleo mineral	Sigma-Aldrich	M5904-5ML	Para calibrar o volume de injeção da agulha.
Pipetas de transferência	Qualquer marca		Movendo embriões
Lâmina	Thermo Fisher	11295-10	Agulha de injeção de corte, corte de cauda de peixes adultos.
incubadora			Manutenção de embriões a 28,5 C.
Extrator de pipetas verticais	David Kopf Instrumentos	700C	Agulhas de geneato para injeção. Instruções adicionais de tração da agulha: http:// cshprotocols.cshlp.org/ conteúdo/2006/7/pdb.prot4651.long
Tubos capilares	Instrumentos Sutter	BF100-58-10	Agulhas de geneato para injeção.
Pontas de microcarregadeira	Eppendorf	930001007	Colocar a solução em agulhas de injeção
Microinjetor	Instrumentos de precisão mundiais	PV 820	Injetando embriões.
Microscópio de dissecação	Leica		Injetando embriões.
microondas	Qualquer marca		Placa de injeção de fundição, géis de agarose.
escala	Qualquer marca		Placa de injeção de fundição, géis de agarose.
Luvas	Qualquer marca		Para todos os aspectos do protocolo.
N2	Qualquer marca		Para expelir líquido do capilar para injeção de embriões
Tubos de tiras de PCR	Qualquer marca		Para todos os aspectos do protocolo.
Ponteiras de 200 μL	Qualquer marca		Para todos os aspectos do protocolo.
Ponteiras de 10 μL	Qualquer marca		Para todos os aspectos do protocolo.
Micropipetas	Qualquer marca		Para todos os aspectos do protocolo.