Microinjeção de embriões: uma técnica para entregar um composto na gema do peixe-zebra

Resumo

Fonte: Sorlien, E. L., et al. Produção e identificação eficientes de nocautes genéticos gerados por CRISPR/Cas9 no sistema modelo Danio rerio. J. Vis. Exp. (2018).

Este vídeo descreve uma técnica de microinjeção de embriões para entregar compostos no saco vitelino de peixe-zebra.

Protocolo

1. Microinjeção de componentes CRISPR em embriões de peixe-zebra

1. Configure tanques de reprodução na noite anterior à injeção, colocando o número de machos e fêmeas desejados (normalmente 2 fêmeas e 1 ou 2 machos) em um tanque de reprodução com uma divisória no lugar.
2. Prepare uma placa de microinjeção com 1,5% de agarose em 1x meio E3 (ver Tabela de Materiais) com 0,01% de azul de metileno (um fungicida) despejando 35 mL de agarose derretida em uma placa de Petri de 10 cm e coloque suavemente um molde de plástico para criar calhas em forma de cunha na solução, batendo no molde para eliminar bolhas de ar.
3. Deixar endurecer....

Resultados

Figura 1: Comparação da saúde de 24 embriões injetados hpf. Um embrião vivo (A) desenvolvido a 24 hpf, é facilmente distinguido de um embrião que abortou o desenvolvimento (B). Embriões que se assemelham a (B) ou têm características drasticamente alteradas para (A), como curvatura da coluna vertebral ou desenvolvimento alterado da cabeça e dos olhos, devem ser removidos do prato

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Água livre de RNase	Qualquer marca		Síntese de RNAs guia. Thermo Fisher e Qiagen carregam água adequada.
Meios de embriões E3	Feito em casa		Meios para criação de embriões e fazendo injeciton plate. Receita: http://cshprotocols.cshlp.org/ content/2011/10/pdb.rec66449
Azul de metileno	Sigma-Aldrich	M9140	Adicionado a 1x meio E3 para prevenir o crescimento de fungos em embriões.
Placa de Petri	Thermo Fisher	FB0875711Z	Armazenar embriões de fundição em placa de injecção
agarose	Denville	CA3510-8	Placa de injeção de fundição, géis de agarose.
Molde de microinection	Ferramentas científicas adaptativas	TU-1	Para criar poços para conter embriões durante a injeção
Vermelho de fenol	Sigma-Aldrich	Pág. 0290	Corante para visualização de injeção
Óleo mineral	Sigma-Aldrich	M5904-5ML	Para calibrar o volume de injeção da agulha.
Pipetas de transferência	Qualquer marca		Movendo embriões
Lâmina	Thermo Fisher	11295-10	Agulha de injeção de corte, corte de cauda de peixes adultos.
incubadora			Manutenção de embriões a 28,5 C.
Extrator de pipetas verticais	David Kopf Instrumentos	700C	Agulhas de geneato para injeção. Instruções adicionais de tração da agulha: http:// cshprotocols.cshlp.org/ conteúdo/2006/7/pdb.prot4651.long
Tubos capilares	Instrumentos Sutter	BF100-58-10	Agulhas de geneato para injeção.
Pontas de microcarregadeira	Eppendorf	930001007	Colocar a solução em agulhas de injeção
Microinjetor	Instrumentos de precisão mundiais	PV 820	Injetando embriões.
Microscópio de dissecação	Leica		Injetando embriões.
microondas	Qualquer marca		Placa de injeção de fundição, géis de agarose.
escala	Qualquer marca		Placa de injeção de fundição, géis de agarose.
Luvas	Qualquer marca		Para todos os aspectos do protocolo.
N2	Qualquer marca		Para expelir líquido do capilar para injeção de embriões
Tubos de tiras de PCR	Qualquer marca		Para todos os aspectos do protocolo.
Ponteiras de 200 μL	Qualquer marca		Para todos os aspectos do protocolo.
Ponteiras de 10 μL	Qualquer marca		Para todos os aspectos do protocolo.
Micropipetas	Qualquer marca		Para todos os aspectos do protocolo.