Xenoenxerto derivado de paciente de peixe-zebra (zPDX): um modelo de câncer

Resumo

Fonte: Wang L. et. al., Modelo de Xenoenxerto Heterogêneo Derivado do Paciente de Câncer de Pâncreas Usando Larvas de Peixe-Zebra como Hospedeiros para Avaliação Comparativa de Medicamentos. J. Vis. Exp. (2019).

Este vídeo descreve a técnica para criar um modelo de xenoenxerto derivado de paciente peixe-zebra. No protocolo da amostra, avaliamos a eficiência dos fármacos Gemcitabina e Navitoclax no modelo de xenoenxerto de tumor pancreático.

Protocolo

1. Injetando Suspensão de Células Mistas no Peixe-Zebra

1. Adicione 10x solução de tricaína na água E3 para anestesiar as larvas de peixe-zebra e transfira as larvas (da etapa 2.3) para a placa de injeção preenchida com E3 modificado (E3 com 1 g/L de glicose e 5 mmol/L de L-glutamina).
2. Encha 25 μL de suspensão de células mistas na agulha de microcapilares e insira a agulha no manipulador de microinjeção.
3. Defina a pressão e o tempo de injeção. Injete 50-80 células (~ 8 nL) no saco vitelino de 48 hpf peixe-zebra.

2. Cultura do Peixe-zebra Xenoenxtado (Modelo zPDX)

1. Transferir as larvas de peixe-zebra pós-xenoenxertadas para 40 ml de solução de mistura (solução E3 com 1 g/L de glucose e 5 mmol/L de L-glutamina) a 32 °C.

3. Administração de medicamentos no peixe-zebra xenoenxertado e a avaliação da viabilidade de células tumorais/fibroblastos

1. Determinação da concentração ideal de gencitabina/navitoclax.
   1. Coloque 10 embriões de peixe-zebra do tipo selvagem a 48 hpf em cada poço de uma placa de 12 poços.
   2. Adicionar diferentes concentrações de gencitabina ou navitoclax em cada alvéolo e incubar a 32 °C durante dois dias.
   3. Após 2 dias, calcule a dose de tolerância máxima (MTD) de gencitabina e navitoclax na qual as larvas de peixe-zebra não apresentaram malformação significativa e comportamento anormal, e as concentrações de trabalho são definidas abaixo do MTD.
2. Tratamento de modelos zPDX com gencitabina/navitoclax.
   1. Coloque 10 larvas xenoenxertadas em cada poço de uma placa de 12 poços.
   2. Divida as larvas em quatro grupos, trate o grupo controle em E3 contendo 0,1% de DMSO e trate os outros grupos com 5 μg / mL de gencitabina e / ou 50 μM de navitoclax e incube a 32 ° C por dois dias.
3. Avaliação das viabilidades celulares e composição celular em modelos zPDX.
   1. Anestesiar as larvas xenoenxertadas no pós-tratamento e colocá-las em metilcelulose a 3%.
   2. Mage as larvas da vista lateral usando um microscópio de fluorescência ou microscópio confocal.
   3. Quantifique a intensidade dos sinais de fluorescência vermelha e verde usando o software ImageJ e GraphPad.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
L-glutamina	GIBCO	21051024
Gemcitabina	Gemzan
Metilcelulose	sigma	M0262
Navitoclax (ABT-263)	Selleck	S1001	Inibidor de Bcl-xL
equipamento
Microinjetor	NARISHIGE
Microscópio Confocal	LEICA	SP8	0,00