Dissecção do coração: um método para observar o desenvolvimento cardíaco do peixe-zebra

Neste artigo

Resumo

Fonte: Singleman C. et. al., Dissecção do coração em peixes-zebra larvais, juvenis e adultos, Danio rerio. J. Vis. Exp. (2011).

Este vídeo descreve uma técnica de isolamento do coração de um peixe-zebra em vários estágios de desenvolvimento para estudar o desenvolvimento, maturação e envelhecimento cardíaco.

Protocolo

1. Medição de peixes e dissecação

Coloque o peixe em uma placa de Petri cheia até a metade com PBS fresco e coloque-o no lado direito.
Meça o comprimento do peixe do focinho à base da cauda (o pedúnculo caudal), não incluindo as barbatanas da cauda, usando um paquímetro digital mm (Figura 1). Este é o comprimento padrão (SL).
Cada peixe pode receber uma combinação de número / letra para permitir que um peixe individual e o coração dissecado resultante sejam rastreados para análise posterior. Os dados, incluindo número de estoque parental, idade de fixação, medidas do CB, foram inseridos em uma planilha e organizados com base nesses rótulos.
Antes da dissecação, rotule as tiras de tubo de PCR com o número de rastreamento atribuído e preencha com PBT ou outra solução apropriada para análise posterior.
Oriente o lado ventral do peixe para cima em placa de Petri enquanto estabiliza o corpo com uma pinça segurando a cabeça entre os olhos e as guelras (Figura 1).

Peixes menores (menores que 12 mm SL):

a) Usando uma pinça afiada ou uma microagulha em um porta-alfinetes, remova os músculos peitorais e as barbatanas do corpo para revelar o coração. O movimento constante da pinça durante a dissecação pode causar correntes no PBT que movem os peixes. Isso é particularmente problemático para peixes menores, portanto, uma microagulha pode ser usada para remover músculos peitorais e barbatanas e abrir a cavidade corporal.
a) Use suavemente a pinça para retirar o coração da cavidade sob o átrio. Como alternativa, em alguns peixes, você pode remover o coração puxando suavemente o bulbo para fora e o resto do coração seguirá. Tenha cuidado com a localização do átrio se estiver usando esta técnica, pois ele pode ser facilmente danificado. Se houver tecido extra que vem com o coração, tudo bem e pode ser limpo depois.
a) Se o peixe contiver um marcador cardíaco fluorescente, como Tg (myl7: GFP) ^twu34, use o escopo fluorescente para dissecção e verifique a remoção do coração por florescência (Figura 2).
a) Uma vez que o coração é removido da cavidade, use a pinça para segurar o coração e uma microagulha para remover o tecido não cardíaco extra e o revestimento epicárdico do lado de fora do coração.

Peixes maiores (maior que 12 mm SL):

b) Com microtesoura com cabo de mola, faça três incisões com menos de 1mm de profundidade: 1- corte transversal através das brânquias 2- corte transversal na barriga anterior 3- corte sagital no lado ventral conectando os dois cortes (Figura 3).
b) Com uma pinça afiada, remova os músculos peitorais e as nadadeiras do corpo para abrir a cavidade corporal e revelar o tecido prateado do pericárdio (Figura 4A). Remova esse tecido pericárdico e o coração ficará visível (Figura 4B).
b) Use a microtesoura para cortar a artéria conectada ao arteriosus bulboso, localizado acima do coração. Uma vez que esta artéria é cortada, coloque as pontas da pinça sob o átrio, use a pinça para retirar o coração da cavidade. Se houver tecido extra que vem com o coração, tudo bem e pode ser removido mais tarde.
b) Uma vez que o coração é removido da cavidade, use as duas pinças para segurar o coração e remover o tecido extra, ou um par de pinças para segurar o coração e uma microagulha para remover o tecido extra não cardíaco. O revestimento epicárdico, evidente por sua pigmentação preta, pode ser removido da parte externa do coração, se desejado, raspando suavemente o tecido.

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Resultados

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Figura 1.Segure o peixe com uma pinça entre os olhos e as guelras.

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Figura 2.Um marcador transgênico fluorescente específico para o coração, como Tg(myl7:GFP)^twu34, mostrado aqui, pode ajudar na visualização de corações dissecados de peixes menores.