Dissecção do cérebro do peixe-zebra: uma técnica de neurobiologia de peixes

Resumo

Fonte: Lopez-Ramirez M. A. et. al., Isolamento e Cultura de Neuroesferas Derivadas do Cérebro de Peixe-Zebra Adulto. J. Vis. Exp. (2016).

Este vídeo descreve a técnica de microdissecção do cérebro de um peixe-zebra adulto. Este método ajuda na obtenção de neurosferas derivadas de todo o cérebro que podem ser estudadas mais a fundo.

Protocolo

1. Dissecção do cérebro do peixe-zebra adulto

1. Prepare um leito de dissecação enchendo uma placa de Petri de 100 mm x 15 mm com bolsas de gelo em gel. Em seguida, coloque a tampa na placa de Petri e incube a -20 °C até que o gel congele. Em cima da tampa, coloque um quadrado de papel de filtro limpo e embrulhe o papel de filtro e a placa de Petri com filme plástico.
2. Limpe e esterilize todos os instrumentos de microdissecção com etanol a 70% ou calor antes de cada uso. Coloque todos os instrumentos de dissecção esterilizados perto do microscópio de dissecação e, logo antes da eutanásia, coloque o leito de dissecção sob o microscópio com iluminação por fibra óptica.
3. Colete 2 peixes-zebra adultos para uma preparação de neuroesferas cerebrais inteiras; e 3 a 4 peixes-zebra para gerar neuroesferas a partir de regiões cerebrais dissecadas.
4. Eutanasiar peixe-zebra adulto (8-12 meses de idade) usando um protocolo aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais. Em seguida, mergulhe o peixe em etanol a 75% por 5-10 segundos e coloque rapidamente no leito de dissecação seguido de decapitação ao nível das brânquias usando uma lâmina cirúrgica.
   1. Para sacrificar animais, administre uma overdose (300 mg / L) de metanossulfonato de tricaína até que o batimento cardíaco do animal diminua gradualmente e a circulação pare, depois mergulhe em água gelada.
5. Vire a cabeça com o lado dorsal para baixo e, usando a tesoura, faça um corte longitudinal do lado cortado até a boca. Usando a pinça, exponha a base do crânio e remova todo o tecido adjacente. Corte as paredes laterais do crânio do início da medula espinhal em direção ao tectum.
6. Usando a tesoura, corte e remova os nervos ópticos e, em seguida, remova os dois lados da parte mais lateral do crânio ao nível do tectum. Vire a cabeça com o lado ventral para cima. Usando uma pinça, retire o resto da parte mais apical do crânio.
7. Transfira o cérebro junto com a parte restante do crânio para um novo prato com o meio de dissecção (DMEM / F12 com penicilina / estreptomicina). Limpe o tecido cerebral no meio de dissecção usando o cabo de plástico da microfaca, mantendo todas as estruturas cerebrais intactas.
8. A partir deste ponto, continue o protocolo usando todo o cérebro do peixe-zebra.
   1. Alternativamente, adapte este protocolo a regiões cerebrais específicas para gerar neuroesferas a partir de todo o cérebro do peixe-zebra ou do telencéfalo, tectum / diencéfalo ou cerebelo dissecado com um bisturi fresco. Use uma linha neural transgênica fluorescente específica do peixe-zebra para dissecar a região do cérebro de interesse de acordo com a Figura 1.

Resultados

Figura 1: Diferenciação de neuroesferas derivadas do cérebro do peixe-zebra.(AC, E) Imagens de contraste de fase de neuroesferas derivadas do cérebro inteiro cultivadas no meio de diferenciação Z durante 1 (A, DiVd1), 3 (B, DiVd3) e 4 (C e D, DiVd4) dias. (E) Vista dorsal de todo o céreb...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
DMEM/F12 1x	Tecnologias da Vida	11330-032
Penicilina-estreptomicina	Tecnologias da Vida	15140-122
Tricaína MS-222	sigma	Rolamento A5040	solução-mãe de 4 mg/ml