Injeção ortotópica: implante de células cancerígenas específicas do tecido em um camundongo adulto

Resumo

Fonte: Katsuta, E., et al. Gerando um modelo de câncer de mama metastático ortotópico murino e realizando mastectomia radical murina.J. Vis. Exp.(2018).

O vídeo demonstra a técnica de inoculação ortotópica do câncer de mama em um modelo de camundongo. Esta técnica produz uma alta taxa de tumorigênese com menos variabilidade no tamanho e forma do tumor em comparação com a injeção subcutânea ou não cirúrgica.

Protocolo

1. Preparação de células (para 10 camundongos)

NOTA: As células devem ser inoculadas dentro de 1 h após serem destacadas do prato para evitar a diminuição da viabilidade celular. Especificamente, a suspensão celular deve ser misturada à mistura de proteínas gelatinosas dentro de 15 minutos após separar as células do prato para manter sua viabilidade.

1. Cultura de células 4T1-luc2, uma linhagem celular de adenocarcinoma mamário de camundongo que expressa luciferase, em meio RPMI 1640 com 10% de FBS em uma incubadora umidificada a 37 ° C em 5% de CO₂.
2. Lave as células 4T1-luc2 aderentes em um prato de 10 cm com solução salina tamponada com fosfato (PBS) usando uma pipeta sorológica de 10 mL. Adicione 1 mL de tripsina a 0,25% usando uma pipeta P1000 e, em seguida, incube a amostra a 37 ° C por 5 min. Em seguida, adicione 4 mL de meio de crescimento (RPMI-1640 com 10% de FBS) usando uma pipeta sorológica de 5 mL e transfira a suspensão celular para um tubo cônico de 15 mL em uma capa de cultura de tecidos. Centrifugue a suspensão da célula a 180 x g por 5 min.
3. Aspire o sobrenadante e ressuspenda as células em 2 mL de PBS; em seguida, conte as células usando o hemocitômetro.
4. Suspender 2 x 10^{6 células} 4T1-luc2 em 40 μL de PBS frio (pH 7,4, 4 °C) na capa de cultura de tecidos.
5. Misture a suspensão de células de 40 μL com 360 μL da mistura de proteínas gelatinosas em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL em gelo na coifa de cultura de tecidos.
   NOTA: A concentração final é de 1 x 10⁵/20 μL (1:9 PBS: mistura de proteínas gelatinosas). Para o modelo ortotópico (sem mastectomia), foi utilizado 1 x 10⁴/20 μL da concentração final, para evitar atingir os critérios de eutanásia (tamanho do tumor > 2 cm) em duas semanas.

2. Inoculação de células cancerígenas

1. Coloque os camundongos na câmara de indução de anestesia com 2-4% de isoflurano e 0,2 L/min de fluxo de oxigênio até que os camundongos respirem calmamente (2–3 min).
2. Segure o mouse e injete 0,05 mg / kg de buprenorfina em seu ombro por via subcutânea.
3. Confirme a anestesia adequada pela falta de reação a um beliscão do dedo do pé. Insira o nariz do camundongo no orifício da máscara do camundongo, que permite anestesia inalatória com isoflurano a 2-4% e fluxo de oxigênio de 2 L/min conectado a uma unidade de recipiente de carvão.
4. Contenha os membros do camundongo usando fita adesiva e esterilize sua pele usando clorexidina, iodo e etanol a 75%, usando cotonetes.
5. Faça uma incisão na pele de 5 mm no meio da parede torácica anterior utilizando uma tesoura de microdissecção estéril, levante a pele do lado direito ao lado da incisão e retire a pele da parede torácica usando a tesoura e, em seguida, inverta a pele para expor a almofada de gordura mamária # 2 direita.
6. Injete cuidadosamente 20 μL de suspensão de células cancerígenas usando uma seringa de insulina de 1 mL com uma agulha de 28,5 G na almofada de gordura sob visão direta através da ferida.
   NOTA: A agulha atravessa a ferida, não a pele. Continue segurando a agulha na almofada de gordura por 5 s antes de retirá-la, o que dá tempo para a mistura de proteínas gelatinosas solidificar.
7. Feche as incisões na pele por costura, usando suturas estéreis 5-0 não absorvíveis.
8. Após a cirurgia, retorne os animais para uma gaiola limpa e monitore-os até que se recuperem e estejam se movendo livremente (após ~ 1–2 min). Se um animal não parecer estar em boas condições de saúde dentro de 24 horas após a cirurgia, administre buprenorfina (0,2 mg / kg).
9. Remova as suturas sob anestesia (consulte a etapa 2.1) 7 dias após a cirurgia.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Tesoura de micro dissecação	Roboz	RS-5983	Para inoculação de células cancerígenas e mastectomia
5-0 suturas de seda	olhar	774B F
Instituto Memorial de Roswell Park 1640	Gibco	11875093	Para cultura de células
Soro fetal bovino	Gibco	10437028	Para cultura de células
Tripsina-EDTA (0,25%)	Gibco	25200056	Para cultura de células
Esterilizante seco (Germinator 500)	Braintree Científico	GER 5287-120V	Para inoculação de células cancerígenas e mastectomia
Porta-agulhas	Roboz	RS-7830	Para inoculação de células cancerígenas e mastectomia
Pinça Adson	Roboz	RS-5233	Para inoculação de células cancerígenas e mastectomia
Clipper	Wahl	Rolamento 9908-717	Para inoculação de células cancerígenas e mastectomia
Matrigel	Corning	354234	Para inoculação de células cancerígenas