Co-cultura 3D com interação direta: co-cultura de células cancerígenas com monócitos para estudar sua interação

Resumo

Fonte: Espinoza-Sánchez, et al. Analisando a comunicação entre monócitos e células primárias de câncer de mama em um sistema tridimensional baseado em extrato de matriz extracelular (ECME). (2018).

Este vídeo descreve a co-cultura 3D de células de câncer de mama com monócitos para estudar sua interação em um ambiente baseado em extrato de matriz extracelular (ECME). Este método ajuda a estudar características específicas, como degradação do colágeno, recrutamento de células imunes e invasão celular.

Protocolo

1. 3D co-culturas com interação direta

1. Rotule células e monócitos BrC com diferentes corantes fluorescentes antes da cultura celular para permitir a classificação independente de cada linhagem celular após a cultura para análise de mRNA e expressão de proteínas. Use derivados comercialmente disponíveis de cumarina e rodamina que passam livremente pela membrana celular de células vivas. Um protocolo geral para rotulagem é o seguinte:
   1. Preparar uma monocamada de células BrC de interesse (2 × 10⁶ células num balão de cultura^{de 25 cm 2}) e substituir o meio padrão por uma solução de trabalho pré-aquecida suficiente do corante fluorescente (1:2 000 do corante fluorescente em meio de base padrão sem qualquer suplemento). Incube 30 min a 37 °C em um ambiente umidificado de 5% de CO₂. Aspire a solução de corante e enxágue suavemente com 1x PBS suficiente. Aspirar o PBS e adicionar o meio padrão.
   2. Tripsinize a monocamada celular com 2 mL de uma solução de tripsina a 0,05% e EDTA 0,48 mM por 5-10 min a 37 °C. Adicione 200 μL de FBS para interromper a tripsinização e 7 mL do meio correspondente sem suplementos. Ressuspenda as células pipetando. Pegue uma alíquota de 10 μL para contar as células em uma câmara de Neubauer. Continue com o protocolo de co-cultura após a contagem de células.
   3. Pulverize as células a 430 x g por 5 min em RT (faça isso primeiro, pois os monócitos crescem em suspensão). Descarte o sobrenadante e ressuspenda suavemente as células com 3 mL de uma solução de trabalho pré-aquecida do corante fluorescente (1:2.000 do corante fluorescente em um meio de base padrão sem suplementos). Incubar durante 30 min a 37 °C num ambiente humidificado de CO₂ a 5%.
   4. Pulverize as células novamente, descarte a solução de trabalho do corante e ressuspenda suavemente com 5-7 mL de 1x PBS. Pellet mais uma vez, descarte o PBS e ressuspenda as células em 5-7 mL de meio padrão. Pegue uma alíquota de 10 μL de suspensão celular para contar as células em uma câmara de Neubauer. Continue com o protocolo de co-cultura após a contagem de células.
2. Defina a co-cultura da seguinte forma: espalhe ECME suficiente no fundo do poço para formar uma camada uniforme em cada poço de um sistema de lâminas de câmara de 4 poços. Placa 20 μL de uma suspensão de célula única contendo 5 × 10⁵ células BrC marcadas por alvéolo.
3. Após 15-20 min de incubação a 37 °C, adicione uma suspensão de 2,5 x 10⁵ monócitos marcados em meio de ensaio de 80 μL (suplementado com 60% de ECME).
4. Deixe o ECME solidificar por 15-20 min a 37 °C.
5. Adicione 1 mL de uma mistura 1:1 das células BrC e meios de cultura de monócitos.
6. Incube coculturas a 37 ° C em um ambiente umidificado de 5% de CO₂ por 24 h, 48 h ou 5 dias para rastrear as mudanças em diferentes pontos de tempo.
7. Degradar proteínas ECM para recuperar as células das culturas. Aspire e descarte o meio, adicione 0,5 mL de 1x PBS com 0,1% de tripsina e 0,25% de EDTA e incube por 3 h a 37 ° C. Após a incubação, adicione 0,5 mL de 1x PBS com 10% de FBS para neutralizar a tripsina e ressuspenda as células pipetando vigorosamente para obter uma suspensão unicelular.
8. Células de pellet a 765 x g por 5 min em RT, descartar o sobrenadante e ressuspender as células em 5 mL de 1x PBS com 10% de FBS. Repita esta etapa uma vez.
9. Submeter a suspensão celular à classificação de células ativadas por fluorescência (FACS) com o instrumento apropriado. Certifique-se de que as populações finais sejam pelo menos 95% puras).
10. Após a triagem, lave as células com 1x PBS estéril, pellet (430 x g por 5 min em RT) e ressuspenda em 1x PBS estéril. As células podem ser processadas de acordo com protocolos específicos para isolamento de RNA ou análise de proteínas.
11. Repita cada ensaio três vezes, incluindo culturas 3D de cada linhagem celular individual como controles.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
U937	Coleção de Cultura Tipo Americano ATCC	CRL-1593.2	Linhagem celular monocítica/linfoma histiocítico
THP-1	Coleção de Cultura Tipo Americano ATCC	TIB-202	Linhagem celular monocítica/leucemia monocítica aguda
MCF-10A	Coleção de Cultura Tipo Americano ATCC	CRL-10317	Linhagem celular mamária não transformada
MCF-7	Coleção de Cultura Tipo Americano ATCC	HTB-22	Linha celular de câncer de mama
MDA-MB-231	Coleção de Cultura Tipo Americano ATCC	HTB-26	Linha celular de câncer de mama
RPMI 1640 médio	GIBCO BRL Life Technologies	11875-093
DMEM/F12	GIBCO BRL Life Technologies	Rolamento 11039-021
Antibiótico/Antimicótico	GIBCO BRL Life Technologies	15240-062	100 U/mL de penicilina, 100 μg/mL de estreptomicina e 0,25 μg/mL de Fungizone
Soro fetal bovino	GIBCO BRL Life Technologies	16000-044
Soro de cavalo	GIBCO BRL Life Technologies	16050114
0,05% Tripsina-EDTA 1X	GIBCO BRL Life Technologies	Rolamento 25300-062
PBS 1X (solução salina tamponada com fosfato	GIBCO BRL Life Technologies	20012-027
Fator de Crescimento Epidérmico (EGF)	PeproTech	AF-100-15 (1,00 mg)
insulina	SIGMA-ALDRICH	I1882-100MG
Hidrocortisona	SIGMA-ALDRICH	H088-5G
Toxina da cólera Vibrio cholerae	SIGMA-ALDRICH	C8052-1MG
Matrigel	Corning Inc	356237	Sarcoma de camundongo Engelbreth-Holm-Swarm (EHS), extrato de matriz extracelular, armazenar a -20 ° C até o uso a 4 ° C
Corrediça de câmara Lab-Tek com tampa (8 poços)	Nalge Nunc Internacional	177402