zPDX-Análise de Invasividade: Investigando o Comportamento Invasivo de Células Cancerígenas Metastáticas em Xenoenxertos de Embrião de Peixe-Zebra

Resumo

Fonte: Ren, J. et al. Comportamento invasivo de células de câncer de mama humano em peixe-zebra embrionário. J. Vis. Exp. (2017).

Este vídeo descreve um método de microinjeção para entrega de células de câncer de mama no espaço perivitelino de embriões transgênicos de peixe-zebra. Após a incubação, visualizamos o embrião sob um microscópio fluorescente para observar a invasão, disseminação e metástase das células cancerígenas.

Protocolo

1. Imagem e análise do processo metastático

1. Colete vários embriões anestesiados com uma pipeta Pasteur de ponta larga e transfira-os para o fundo de vidro de uma placa de poliestireno.
2. Remova o excesso de água e mantenha uma quantidade limitada de água com ovo. Manipule o embrião na posição com uma ferramenta de laço de cabelo e coloque uma tampa em cima do vidro.
3. Use um microscópio confocal invertido em combinação com objetivas de imersão em água ou secas de longa distância. Posicione o embrião de forma que a região de interesse fique o mais próximo possível do objetivo.
4. Realize imagens imediatamente após a anestesia para reduzir o risco de morte devido à evaporação do líquido.
   1. Capture sinais da vasculatura marcada com EGFP e células tumorais marcadas com mCherry na mesma posição nos embriões para co-registrar células injetadas com vasos sanguíneos, fundindo os dois canais de imagem.
   2. Para cada embrião de peixe-zebra, colete dois conjuntos diferentes de imagens da região da cabeça e da região da cauda.
5. Quantifique o número de células disseminadas.
   1. Para injeções no espaço perivitelino, conte o número de células em cada peixe que se disseminaram da massa celular em direção ao corpo embrionário do peixe nas regiões da cabeça e da cauda 4,15; as regiões estão além dos limites da cavidade cardíaca frontalmente, no topo da bexiga natatória dorsalmente e além da abertura urogenital caudalmente.
   2. Para a injeção de Doc, conte o número de células individuais que invadiram as fibras de colágeno da cauda da circulação (MDA-MB-231) ou o número de aglomerados formados por células coletivamente (M2) no tecido hematopoiético caudal (CHT) de cada peixe-zebra19.
6. Estude a invasão e a metástase com mais detalhes usando microscopia confocal (altamente recomendado).
   1. Use baixa ampliação (objetiva de 4X) para obter imagens de todo o corpo e obter uma visão geral do padrão de disseminação das células tumorais.
      NOTA: Maior ampliação (objetivas de 20X e 40X) é adequada para estudar a angiogênese intra e peritumoral e a localização precisa das células disseminadas no corpo embrionário.
   2. Use um laser de 488 nm para escanear a vasculatura do embrião de peixe-zebra e um laser de 543 nm para escanear células tumorais implantadas marcadas com fluorescência vermelha. Obtenha uma imagem de alta qualidade digitalizando cada embrião em oito a dez etapas. Digitalize e calcule a média de cada etapa seis vezes.
7. Coloque cuidadosamente o embrião de volta na água do ovo, se for necessário para outros experimentos.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Pipeta Pasteur de ponta larga (0,5-20 μL)	Eppendorf	F276456I
Microscópio confocal	Leica	SP5 STED
Microscópio estéreo	Leica	MZ16FA
Cepa de peixe-zebra Tg (fli:EGFP)			Gentilmente cedido pela Dra. Ewa SnaarJagalska (Instituto de Biologia, Universidade de Leiden, Leiden, Holanda)
Prato de poliestireno com fundo de vidro	Vontade	GWST-5040
Microscópio estéreo fluorescente	Leica	M165 FC
Tricaína (ácido 3-aminobenzóico)	SigmaAldrich	A-5040