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1. Descelularização
NOTA: Este procedimento foi adaptado de métodos publicados anteriormente focados na descelularização adiposa, que incluíam o detergente iônico desoxicolato de sódio em vez de dodecil sulfato de sódio para remover o DNA de forma eficiente.
- No dia 1, remova as almofadas de gordura mamária congeladas ou MFPs de -80 °C e descongele em temperatura ambiente.
- Depois de descongelados, seque os MFPs brevemente em um lenço delicado. Pese os MFPs usando uma balança analítica.
- Usando uma pinça com tesoura ou bisturi, divida o tecido em amostras de 3 mm x 3 mm x 3 mm para estudo da ECM intacta e o tecido restante para produção de hidrogel.
nota: O número de amostras depende do número de métodos de teste, por exemplo, a coleta de duas amostras é descrita abaixo: uma para inclusão em parafina (etapa 1.5) e outra para congelamento em meio de inclusão em criostato, se desejado (consulte a Tabela de Materiais e a etapa 1.6).
- Pese os lenços. Se for embutir em parafina para seccionamento, continue na etapa 1.5. Se congelar em meio de incorporação de criostato para seccionamento, continue para a etapa 1.6.
- Em uma coifa química, mergulhe o tecido em formalina tamponada neutra a 10% (NBF) (consulte a Tabela de Materiais) por 24 h a 4 ° C. Lave 3 vezes em PBS por 5 min cada. Mergulhe o tecido em sacarose a 30% por 48 h a 4 ° C.
- Pese o lenço agora que esta peça foi removida. Continue para a etapa 1.6.
- Em uma capa química, coloque as peças do MFP em um rotulado preparado com meio de incorporação de criostato. Adicione mais meio de inclusão de criostato para cobrir o tecido.
- Coloque o em um béquer de 2-metilbutano (consulte a Tabela de Materiais) que é pré-resfriado com nitrogênio líquido. O copo deve ter 2-metilbutano suficiente para cobrir o fundo, mas não o suficiente para submergir o, porque o meio de incorporação do criostato não deve tocar no 2-metilbutano. Deixe o descansar no 2-metilbutano até que o meio de incorporação do criostato congele e se torne opaco.
- Embrulhe o(s)(s) em papel alumínio, rotule e deixe a -80 °C até ser usado para seccionamento.
nota: Os tecidos colocados imediatamente em meio de inclusão de criostato foram seccionados a 5 μm, enquanto os tecidos incubados em sacarose foram seccionados a 30 μm para reter a morfologia dos adipócitos.
- Use uma pinça para massagear manualmente o tecido restante.
nota: Os pedaços de tecido também podem ser colocados em NBF a 10% por 24 a 48 h, enxaguados em PBS e deixados em etanol a 70% até serem incluídos em parafina. Após a incorporação, seções de 5 μm podem ser usadas para coloração de hematoxilina e eosina (H & E) (consulte a seção 2 abaixo).
- Coloque os MFPs em pratos de 6 cm com 5 mL de solução de tripsina a 0,02% / EDTA a 0,05%. Incubar a 37 °C durante 1 h. Pulverize e limpe a louça com etanol 70% antes de colocá-la na incubadora.
- Use filtros de 0,7 mm para lavar os MFPs com água deionizada (DI), derramando água sobre o tecido três vezes. Use uma pinça para massagear manualmente o tecido entre as lavagens.
- Seque brevemente o tecido em uma tarefa delicada, limpe e pese. Coloque os lenços de papel em um copo pré-autoclavado contendo uma barra de agitação de tamanho apropriado. Cubra os tecidos com 60 mL de t-octilfenoxipolietoxietanol a 3% (consulte a Tabela de Materiais) por 1 g de tecido e mexa por 1 h em temperatura ambiente. Use um mínimo de 20 mL.
- Despeje o lenço de papel e o conteúdo em uma peneira. Enxágue o béquer com água DI e despeje sobre os lenços de papel. Repita mais duas vezes. Use uma pinça para massagear manualmente o tecido entre os enxágues.
- Seque brevemente o tecido em uma tarefa delicada, limpe e pese. Coloque os lenços e as barras de agitação de volta nos mesmos copos e cubra com 60 mL de ácido desoxicólico a 4% por 1 g de tecido. Mexa por 1 h em temperatura ambiente. Use um mínimo de 20 mL.
- Despeje o tecido e o conteúdo em uma peneira de malha. Enxágue o béquer com água DI e despeje sobre os lenços de papel. Repita mais duas vezes. Use uma pinça para massagear manualmente o tecido entre os enxágues.
- Seque brevemente o tecido em uma tarefa delicada, limpe e pese.
- Coloque os lenços no mesmo béquer com água DI fresca suplementada com penicilina-estreptomicina a 1%. Cubra bem com filme de parafina. Deixar durante a noite a 4 °C.
- Lave os filtros e copos para usar no dia seguinte.
- No dia 2, escorra o conteúdo do béquer para uma peneira. Seque brevemente o tecido em uma tarefa delicada, limpe e pese.
- Coloque as MFPs no mesmo copo com uma barra de agitação de tamanho apropriado. Cubra com 60 mL de etanol a 4% / solução de ácido peracético a 0,1% por 1 g de tecido. Use um mínimo de 20 mL. Mexa por 2 h em temperatura ambiente.
- Despeje o tecido e o conteúdo em uma peneira de 0,7 mm. Use uma pinça para massagear manualmente o tecido. Coloque o conteúdo de volta no copo. Lave o tecido cobrindo-o com 60 mL de 1x PBS por 1 g de tecido. Use um mínimo de 20 mL. Mexa por 15 min em temperatura ambiente. Repita uma vez.
- Despeje o tecido e o conteúdo em uma peneira de 0,7 mm. Use uma pinça para massagear manualmente o tecido. Coloque o conteúdo de volta no copo. Lave o tecido cobrindo-o com 60 mL de água DI por 1 g de tecido. Use um mínimo de 20 mL. Mexa por 15 min em temperatura ambiente. Repita uma vez.
- Seque brevemente o tecido em uma tarefa delicada, limpe e pese. Despeje o lenço de papel e o conteúdo em uma peneira. Use uma pinça para massagear manualmente o tecido.
- Coloque o conteúdo de volta no copo. Cubra os tecidos com 60 mL de n-propanol 100% por 1 g de tecido. Use um mínimo de 20 mL. Mexa por 1 h em temperatura ambiente.
- Seque brevemente o tecido em uma tarefa delicada, limpe e pese. Despeje o tecido e o conteúdo em uma peneira de 0,7 mm. Use uma pinça para massagear manualmente o tecido.
- Coloque o conteúdo de volta no copo. Lave o tecido cobrindo-o com 60 mL de água DI por 1 g de tecido. Use um mínimo de 20 mL. Mexa por 15 min em temperatura ambiente. Repita três vezes.
- Despeje o lenço de papel e o conteúdo em uma peneira. Repita as etapas 2.3–2.6 para coletar pedaços de tecido para incubação e congelamento de sacarose em meio de inclusão de criostato.
- Seque brevemente o tecido em uma tarefa delicada, limpe e pese. Coloque em um tubo rotulado de 15 mL. Congele a -80 °C durante a noite.