Escalonamento de dose: um método para desenvolver resistência a medicamentos em células cancerígenas

Resumo

Fonte: Yamaoka T. et al., Estabelecimento e caracterização de três linhagens celulares de adenocarcinoma de pulmão PC-9 resistentes a afatinibe desenvolvidas com doses crescentes de afatinibe. J. Vis. Exp., 2019

O vídeo descreve o desenvolvimento de resistência a medicamentos em células cancerígenas, expondo as células a doses crescentes de um medicamento após calcular os valores de IC₅₀ do medicamento previamente com o ensaio MTT. O protocolo de amostra descreve o processo passo a passo de desenvolvimento de células resistentes a medicamentos.

Protocolo

1. Estabelecimento de três linhagens celulares PC-9 independentes resistentes ao afatinibe

1. Determinação da concentração inicial de exposição ao afatinibe para células PC-9 usando o ensaio de brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio (MTT).
   1. Cultura de células PC-9 em meio de crescimento contendo soro fetal bovino (10%), penicilina (100 U/mL) e estreptomicina (100 μg/mL) em uma placa de 10 cm tratada com cultura de células em uma incubadora de CO 5%₂ a 37 °C.
   2. Ressuspenda as células PC-9 a 4 x 10⁴ células / mL em meio de crescimento e, em seguida, semeie a 50 μL / poço em uma microplaca de 96 poços. A concentração final de células é de 2,0 x 10³ células/50 μL/poço. Incubar durante a noite em uma incubadora de 5% de CO₂ a 37°C.
   3. Adicionar 50 μL de solução de afatinib em diferentes concentrações: 0, 0,002, 0,006, 0,02, 0,06, 0,2, 0,6, 2, 6 e 20 μM aos alvéolos que contêm o meio de crescimento (50 μL). O volume final e as concentrações de afatinibe são 100 μL e 0, 0,001, 0,003, 0,01, 0,03, 0,1, 0,3, 1, 3 e 10 μM, respectivamente.
   4. Incubar a placa de 96 poços durante 96 h numa incubadora de CO_{5% 2} a 37 °C.
   5. Adicione 15 μL da solução de corante (ver Tabela de Materiais) a cada poço e incube por 4 h em uma incubadora de CO₂ a 5% a 37 ° C e, em seguida, adicione 100 μL de solução de solubilização / parada (consulte a Tabela de Materiais) a cada poço e incube durante a noite em uma incubadora de CO₂ a 5% a 37 ° C.
   6. Meça a densidade óptica a 570 nm (OD₅₇₀) usando um leitor de microplacas (consulte a Tabela de Materiais). Prepare 6-12 réplicas e repita os experimentos pelo menos três vezes.
   7. Use software estatístico (consulte Tabela de Materiais) para plotar graficamente esses dados como um gráfico semi-log e calcular o valor IC₅₀, que é a concentração do medicamento que reduz a resposta a 50% de seu máximo (consulte Tabela de Materiais).
2. Exposição contínua de células PC-9 ao EGFR-TKI irreversível, afatinibe, por escalonamento gradual da dose em três placas independentes de 10 cm
   1. Cultura de células PC-9 em placas p100 contendo 10 mL de meio de crescimento. Quando as células PC-9 atingirem o estágio subconfluente, transfira 1 mL de suspensão celular para três novas placas p100, com 9 mL de meio de crescimento. As células PC-9 diluídas em 1:10 tornam-se subconfluentes em 3-4 dias, com um número de células de aproximadamente 4-5 x 10⁵ células/mL.
   2. No dia seguinte, adicione 1/10 do valor IC₅₀ de afatinibe em cada uma das três placas p100.
      NOTA: O afatinibe é reconstituído em DMSO em concentrações de estoque de 1 μM, 10 μM, 100 μM, 1 mM e 5 mM. 1 a 10 μL de solução de afatinibe são adicionados a 10 mL de meio de crescimento na cultura, de acordo com as concentrações finais necessárias.
   3. Quando as células nas placas de p100 contendo afatinibe se tornarem subconfluentes, misture bem por aspiração com uma pipeta de 1 mL e adicione 1 mL da suspensão celular a 9 mL de meio de crescimento fresco em uma nova placa de p100. Em seguida, adicione concentrações 10-20% mais altas de afatinibe à nova cultura.
   4. Aumentar a concentração de afatinibe de 0,1 nM para 1 μM no meio pelo escalonamento gradual da dose, com a concentração de afatinibe aumentada em 10-20% em cada etapa durante o período de 10-12 meses.
      nota: Quando a concentração de afatinibe se aproxima do valor IC₅₀, o crescimento celular torna-se bastante lento. Se as células forem divididas em 1:9, elas podem não crescer, pois essas células são mortas por concentrações mais altas de afatinibe. Portanto, em concentrações mais altas de afanitibe, as células podem ser divididas na proporção de 1:2. As células mais resistentes foram cultivadas em meio contido em afatinibe por 3-14 dias, e o meio não foi alterado até que as células resistentes precisassem ser passadas.
   5. Cultive as células resistentes ao afatinibe por 2-3 meses em meio de crescimento contendo 1 μM de afatinibe. A uma concentração de afatinibe de 1 μM, são necessários 10-12 meses para desenvolver resistência ao afatinibe neste modelo. Realize o ensaio MTT para confirmar que as células são resistentes ao afatinibe. As três linhas celulares de resistência ao afatinibe estabelecidas independentemente foram denominadas AFR1, AFR2 e AFR3.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
FBS	gibco	Rolamento 26140-079
Estreptococos de caneta	gibco	15140-163
Prato de 10 cm tratado com cultura de células	Violamo	Rolamento 2-8590-03
afatinibe	Selleck	S1011
Microplaca de 96 poços	Thermo	130188
CellTiter 96	Promega	G4100	Ensaio de Proliferação de Células Não Radioativas; Solução de corante e solução de solubilização/parada
Espectrofotômetro NanoDrop Lite	Thermo	NA	espectrofotômetro
Software GraphPad Prism v.7	GraphPad, Inc.	NA	um software estatístico
Dmso	Wako	Telefone: 043-07216