Ensaio de formação de colônias: avaliando a eficácia de agentes anticancerígenos em células de câncer de pulmão formadoras de colônias

Resumo

Fonte: Lee, J. Y.et al, Avaliação pré-clínica da bioatividade da cumarina anticâncer OT48 por esferoides, ensaios de formação de colônias e xenoenxertos de peixe-zebra.J. Vis. Exp. (2018).

Este vídeo descreve o ensaio de formação de colônias, que ajuda a determinar a capacidade das células de câncer de pulmão de proliferar indefinidamente e formar colônias individuais. Podemos analisar o efeito de um agente anticancerígeno nas células formadoras de colônias, analisando as mudanças no número e / ou tamanho das colônias resultantes.

Protocolo

1. Ensaios de formação de colônias

1. Cultura de células A549 na concentração de 20.000 células/^cm2 em 15 mL de meio de cultura celular RPMI1640 suplementado com 10% de FBS (soro fetal bovino) e 1% de antibióticos em um frasco de 75^cm2 em uma incubadora de CO₂ a 37 °C e 5% de CO₂.
2. No dia do experimento, determine a concentração celular usando um hemocitômetro. Colete 50.000 células por centrifugação a 400 x g por 7 min em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL e ressuspenda as células em 100 μL de PBS (solução salina tamponada com fosfato) estéril em tubos de 1,5 mL.
3. Dispense 1,1 mL de meio semissólido à base de metilcelulose (MCBM) em tubos de 15 mL com uma multipipeta. Prepare um tubo para cada condição.
4. Adicione 110 μL de FBS a 1,1 mL de MCBM usando uma micropipeta P200.
5. Sementes de células a 1.000 células/mL. Colete 2,4 μL de suspensão celular da solução estoque (50.000 células em 100 μL de 1x PBS) usando uma micropipeta P2 e adicione 1,1 mL de MCBM suplementado com 10% de FBS.
6. Depois de adicionar as células, faça um vórtice nos tubos por 1 min, segurando-os verticalmente na velocidade mais alta para misturar bem o MCBM e as células.
7. Adicionar compostos de ensaio (OT48 isoladamente ou em combinação com A1210477). Preparar um tubo separado como controlo para o solvente utilizado [neste caso, dimetilsulfóxido (DMSO)]. Dependendo da concentração dos compostos e do volume adicionado para cada condição, o controlo do solvente incluirá a concentração mais elevada de solvente utilizada para as diluições do composto de ensaio, a fim de avaliar os efeitos adversos causados pelo solvente.
8. Tubos de vórtice por 1 minuto.
9. Para cada ensaio, adicione 1 mL da mistura com uma micropipeta P1000 ao poço central de uma placa de cultura de células de 12 poços.
10. Encha os poços vazios com 1 mL de água estéril ou 1x PBS para estabilizar a umidade.
11. Incubar placas de cultura durante 10 dias numa incubadora a 37 °C e 5% de CO₂
12. Após 10 dias de incubação, adicione 200 μL de uma solução-mãe de MTT (5 mg / mL) de brometo de MTT (5 mg / mL) a cada poço para atingir uma concentração final de 1 mg / mL.
13. Incubar 10 min em uma incubadora a 37 °C e 5% de CO₂. As colônias viáveis ficarão violetas.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Resposta 549	ATCC	CCL-185	37 C°
RPMI 1640	Lonza	Rolamento 30096	4 C°
FBS	Biooeste	S1520-500	-20 C°
Penicilina-estreptomicina	Lonza	17-602E	-20 C°
Balão de cultura de células T75	Spl	Nº 70075	Rt
Solução PBS	Hyclone	SH30256.02	Rt
Tubo de 1,5 ml	Extragene	Tubo-170-C	Rt
Tubo de 15 ml	Hyundai Micro	H20015	Rt
Placa de 12 poços	Spl	30012	Rt
MethoCult	Tecnologias de células-tronco	Nº 4230	-20 C°
Brometo de tetrazólio azul de tiazolila (pó de MTT)	sigma	M5622	4 C°
LAS4000	Tecnologias de Saúde GE		Rt