Ensaio de Xenoenxerto de Peixe-Zebra: Um Método para Avaliar a Eficácia Anticancerígena da Terapêutica na Tumorigenicidade em Peixe-Zebra In Vivo

Resumo

Fonte: Lee, J. Y et al.,Avaliação pré-clínica da bioatividade da cumarina anticâncer OT48 por esferoides, ensaios de formação de colônias e xenoenxertos de peixe-zebra.J. Vis. Exp. (2018)

Este vídeo descreve o ensaio de xenoenxerto de peixe-zebra para avaliar a formação de tumores in vivo e estudar o efeito de agentes terapêuticos.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.

1. Ensaio de Xenoenxerto de Peixe-Zebra

NOTA: Esta abordagem técnica é visualizada como um esquema (Figura 1).

1. Preparação de reagentes de reserva
   1. Prepare 1 L de solução de Danieau 30x: NaCl 1740 mM, KCl 21 mM, MgSO₄•7H2O 12 mM, Ca(NO₃)₂ 18 mM e HEPES 150 mM. Ajuste o pH do tampão para 7.6 usando um medidor de pH.
   2. Prepare a solução de tricaína a 1% (50x): Dissolva 20 mg de metanossulfonato de etila 3-aminobenzoato (tricaína) em 2 mL de água destilada.
   3. Prepare a solução de fenol vermelho-PBS a 1%: Adicione 2 μL de solução de sal de sódio vermelho de fenol a 198 μL de solução de PBS esterilizada em um tubo de 1,5 μL.
   4. Prepare 3% de metilcelulose: Adicione 3 g de metilcelulose a 100 mL de solução de 1x Danieau.
2. Produção e incubação de ovos de peixe-zebra
   1. Separe uma fêmea e um macho em um tanque divisório cheio de água da torneira esterilizada por UV e filtrada a 28,5 ° C no escuro. Após 24 h de separação, misture peixes de ambos os sexos para iniciar o acasalamento. Transfira os óvulos fertilizados do tanque de acasalamento para uma placa de Petri contendo 5 mL de solução fresca de Danieau.
   2. Lave os ovos três vezes com 5 mL da solução de Danieau. Para a lavagem, aspire cuidadosamente os ovos com uma pipeta e transfira para 5 mL de solução fresca. Incubar durante 8 h a 28,5 °C.
      1. Após 8 h de incubação na solução de Danieau, mude para a solução de Danieau contendo 0,03% de 1-fenil-2-tioureia (PTU) para inibir a pigmentação. Separe os ovos opacos (não fertilizados ou contendo embriões não desenvolvidos) para evitar a contaminação.
3. Descorionação embrionária
   1. 24 h após a fertilização (HPF), descorionar embriões de peixe-zebra usando pinças afiadas. Incubar embriões incubáveis em solução de Danieau com PTU a 0,03% a 28,5 °C até 48 hpf.
4. Preparação de células tratadas com composto
   1. Semear células A549 a 20.000 células/^cm2 em frascos de cultura de 25^cm2. Após 24 h de semeadura, adicione compostos (aqui OT48 a 50 μM e e / ou A1210477 a 20 μM) por 24 h em uma incubadora a 37 ° C e 5% de CO₂.
   2. Configure o tempo de tratamento para cada composto para manter a viabilidade das células, mas para comprometê-las com a morte celular. Este ponto de tempo precisa ser configurado individualmente com base na viabilidade celular, morfologia e marcadores moleculares.
   3. 2 h antes do final do tratamento, corar as células com 4 μM de corante rastreador de células fluorescentes CM-Dil a 37 °C e 5% de CO₂. Após 2 h de incubação, tripsinize as células com 0,05% de tripsina-EDTA e dilua 106 células em 50 μL de solução de fenol Red-PBS antes da injeção.
5. Microinjeção de células cancerígenas para formação de xenoenxerto
   1. Anestesie o peixe-zebra em uma solução de tricaína a 0,02% por 5 minutos até que eles se acomodem em uma placa de ágar.
   2. Puxe um capilar de vidro de 1.0 mm (diâmetro externo (OD)) com um extrator de micropipeta (Configurações do programa: P: 300, Calor: 260, Puxar: 60, VEL: 50 e Tempo: 200). Corte o microcapilar com uma seringa para produzir uma borda afiada. Carregue os microcapilares com 20 μL de solução de célula/fenol Red-PBS. Defina a pressão de injeção e o tempo para dispensar 2 nL por injeção.
   3. Injete 100-200 células no saco vitelino injetando 6 a 10 nL por meio de 3 a 5 injeções. Após a injeção, deixe o peixe se recuperar por 10 a 30 min em 5 mL de solução fresca de Danieau contendo solução de PTU. Despache os peixes em placas de 24 poços com 1 mL de solução de Danieau contendo solução de PTU e incube por 72 h a 28,5 ° C.
   4. Após 72 h de incubação, anestesiar os peixes em solução de tricaína a 0,02% e imobilizar em lâmina de vidro com gota de metilcelulose a 3%. Tire 5 fotos por microscopia de fluorescência em um comprimento de onda de 620 a 750 nm.
   5. Quantifique o tamanho dos tumores fluorescentes pelo software ImageJ. Selecione o menu "Analisar | Meça". Salve os valores correspondentes ao sinal fluorescente e analise com um software de estatística para representação gráfica.

Resultados

Figura 1: Diagrama esquemático do processo geral do ensaio de xenoenxerto de peixe-zebra.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Resposta 549	ATCC	CCL-185	37 C°
RPMI 1640	Lonza	Rolamento 30096	4 C°
FBS	Biooeste	S1520-500	-20 C°
Penicilina-estreptomicina	Lonza	17-602E	-20 C°
Balão de cultura celular T25	Spl	Rolamento 70025	Rt
Balão de cultura de células T75	Spl	Nº 70075	Rt
Balão de cultura celular T175	Spl	Rolamento 71175	Rt
Tubo de 1,5 ml	Extragene	Tubo-170-C	Rt
Placa de 24 poços	Spl	30024	Rt
Petrídish	Spl	10100	Rt
Solução PBS	Hyclone	SH30256.02	Rt
Tripsina-EDTA	Gibco	25-300-054	4 C°
cloreto de sódio	Sigma-Aldrich	Rolamento 71382	Rt
Cloreto de potássio (KCL)	Sigma-Aldrich	Pág. 9541	Rt
Sulfato de magnésio heptahidratado (MgSO4.7H2O)	Sigma-Aldrich	M2773	Rt
Nitrato de cálcio tetra-hidratado [Ca(NO3)2]	Sigma-Aldrich	C1396	Rt
Solução HEPES	Sigma-Aldrich	H0887	Rt
3-aminobenzoato de etilo metanossulfonato (tricaína)	Sigma-Aldrich	E10521	Rt
Solução de Vermelho de Fenol	Sigma-Aldrich	Pág. 0290	Rt
Metilcelulose	Sigma-Aldrich	M0512	Rt
1-fenil-2-tioureia (PTU)	Sigma-Aldrich	Pág. 7629	Rt
Corante CM-Dil	Invitrogen	C7001	-20 C°
Capilar de vidro	Instrumentos de precisão mundiais	TW 100F-4	Rt
Extrator de micropipetas	Instrumento de obturador, EUA	Pág. 97	Rt
Micro injetor	Instrumentos de precisão mundiais	PV820	Rt
seringa	KOVAX	1ml	Rt
Micro carregador	Eppendorf	5242956003	Rt
Corrediça de vidro	Marienfeld	HSU-1000612	Rt
Microscopia de fluorescência	Leica	DE/DM 5000B	Rt