Ensaio de fototoxicidade in vitro: um método baseado em PDT para avaliar o potencial fototóxico de um fotossensibilizador em células de câncer de pulmão

Resumo

Fonte: Chang, J. E., et al. Eficácia anticancerígena da terapia fotodinâmica com nanopartículas direcionadas ao câncer de pulmão.J. Vis. Exp.(2016).

A terapia fotodinâmica (PDT) é um método não invasivo e não cirúrgico para o tratamento do câncer de pulmão. Os fotossensibilizadores se acumulam seletivamente no tecido tumoral e levam à morte das células tumorais na presença de oxigênio e no comprimento de onda adequado da luz. Neste vídeo de protocolo, o método baseado em PDT é usado para avaliar o potencial fototóxico de um potencial fotossensibilizador em células de câncer de pulmão.

Protocolo

1. Síntese de ácido hialurônico-ceramida (HACE)

1. Solubilizar 12,21 mmol de oligômero de ácido hialurônico (AH) e 9,77 mmol de hidróxido de tetra-n-butilamônio (TBA) em 60 ml de água bidestilada (DDW). Mexa por 30 min.
2. Para sintetizar o ligante DS-Y30, dissolver 8,59 mmol de ceramida DS-Y30 e 9,45 mmol de trietilamina em 25 ml de tetrahidrofurano (THF). Misturar com 8,59 mmol de cloreto de 4-clorometilbenzoílo em THF. Mexa por 6 horas a 60 °C.
3. Dissolva os 8,10 mmol sintetizados de HA-TBA e 0,41 mmol do ligante DS-Y30 em uma mistura de THF e acetonitrila (4:1, v/v). Mexa durante 5 horas a 40 °C.
4. Remova as impurezas filtrando com um agente filtrante e elimine o solvente orgânico por evaporação a vácuo. Purifique o produto usando uma membrana de diálise (corte de peso molecular: 3,5 kDa) e liofilize.

2. Preparação das nanopartículas

1. Dissolva 1 mg de HB e 1 mg de paclitaxel em 0,5 ml de dimetilsulfóxido (DMSO) e misture com 0,5 ml de DDW por mistura em vórtice por 5 min. Em seguida, solubilize HACE nessa mistura por mistura de vórtice por mais 5 min.
2. Para eliminar o solvente, aquecer a 70 °C durante 4 horas sob uma corrente suave de gás azoto.
3. Ressuspenda o filme composto de HACE, HB e paclitaxel com 1 ml de DDW. Filtre com um filtro de seringa (tamanho de poro de 0,45 μm) para remover medicamentos não encapsulados.

3. Fototoxicidade in vitro

1. Captação de nanopartículas em linhagens celulares de câncer de pulmão
   1. Prepare o meio RPMI-1640 contendo 10% (v / v) de soro fetal bovino e 1% (p / v) de penicilina-estreptomicina.
   2. Semear células A549 em placas de cultura de células de 24 poços a uma densidade de 1 × 10⁵ células/poço (triplicados para cada grupo). Incubar durante 24 horas a 37 °C numa atmosfera humidificada a 5% de CO₂ e 95% de ar.
   3. Após a fixação celular, remova o meio e lave as células adicionando 1 ml de solução salina tamponada com fosfato (PBS).
   4. Dissolver as nanopartículas em PBS até uma concentração final de 2 μM/ml HB. Em seguida, incube as células com 1 ml de PBS, NPs vazios, HB-NPs ou HB-P-NPs em cada poço por 4 horas no escuro.
   5. Remova toda a solução e lave as células adicionando 1 ml de PBS frio. Repita a etapa de lavagem mais uma vez. Adicione meio de cultura fresco.
2. Ensaio de viabilidade celular
   1. Coloque a placa de cultura de células sob a fibra PDT (com 1 cm de distância da fibra PDT ao poço). Use óculos de segurança para laser e ilumine as células com um laser PDT (630 nm, 400 mW/cm²) no escuro por vários períodos de tempo: 0, 5, 10, 20, 30 e 40 segundos (0, 2, 4, 8, 12 e 16 J/cm²). Em seguida, incube as células por 24 horas no escuro.
   2. Aspirar o meio e lavar as células adicionando 1 ml de PBS frio. Repita a etapa de lavagem mais uma vez.
   3. Adicionar 10 μl de solução de medição de citotoxicidade a cada alvéolo. Incube no escuro por 2 horas.
   4. Medir a absorvância a 450 nm utilizando um leitor de microplacas.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
ácido hialurônico oligo	Fornecedor:Bioland Co., Ltd.
DS-Y30 (ceramida 3B; principalmente noleoil-fitoesfingosina)	Fornecedor:Doosan Biotech Co., Ltd.
ácido adípico di-hidrazida	Sigma Aldrich	Rolamento A0638
N-(3-dimetilaminopropil)-N′-etilcarbodiimida	Sigma Aldrich	Rolamento 39391
cloreto de 4-(clorometil)benzoíla	Sigma Aldrich	270784
Paclitaxel	Corporações Taihua
filtro de seringa	Sartorius Stedim Biotech GmbH	Rolamento 17762	15 mm, RC, PP, 0,45 μm
RPMI-1640	Gibco Life Technologies, Inc.	Rolamento 11875
Penicilina-estreptomicina	Gibco Life Technologies, Inc.	Rolamento 15070
Soro fetal bovino	Gibco Life Technologies, Inc.	16140071
Celite (agente filtrante)	Sigma Aldrich	Nº 6858	Consulte a etapa 1.4