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Todos os procedimentos envolvendo animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária do JoVE.
1. Síntese de ácido hialurônico-ceramida (HACE)
- Solubilizar 12,21 mmol de oligômero de ácido hialurônico (AH) e 9,77 mmol de hidróxido de tetra-n-butilamônio (TBA) em 60 ml de água bidestilada (DDW). Mexa por 30 min.
- Para sintetizar o ligante DS-Y30, dissolver 8,59 mmol de ceramida DS-Y30 e 9,45 mmol de trietilamina em 25 ml de tetrahidrofurano (THF). Misturar com 8,59 mmol de cloreto de 4-clorometilbenzoílo em THF. Mexa por 6 horas a 60 °C.
- Dissolva os 8,10 mmol sintetizados de HA-TBA e 0,41 mmol do ligante DS-Y30 em uma mistura de THF e acetonitrila (4:1, v/v). Mexa durante 5 horas a 40 °C.
- Remova as impurezas filtrando com um agente filtrante e elimine o solvente orgânico por evaporação a vácuo. Purifique o produto usando uma membrana de diálise (corte de peso molecular: 3,5 kDa) e liofilize.
2. Preparação das nanopartículas
- Dissolva 1 mg de HB e 1 mg de paclitaxel em 0,5 ml de dimetilsulfóxido (DMSO) e misture com 0,5 ml de DDW por mistura em vórtice por 5 min. Em seguida, solubilize HACE nessa mistura por mistura de vórtice por mais 5 min.
- Para eliminar o solvente, aquecer a 70 °C durante 4 horas sob uma corrente suave de gás azoto.
- Ressuspenda o filme composto de HACE, HB e paclitaxel com 1 ml de DDW. Filtre com um filtro de seringa (tamanho de poro de 0,45 μm) para remover medicamentos não encapsulados.
3. Eficácia anticancerígena in vivo em camundongos portadores de tumor
- Modelo de camundongo induzido por câncer de pulmão
- Preparar 1 × 106 células A549 em meio RPMI-1640 de 0,1 ml; mantê-lo no gelo.
- Anestesiar os camundongos com uma injeção intravenosa de xilazina e uma mistura de tiletamina e zolazepam (1:2, 1 ml/kg). Confirme a anestesia adequada beliscando suavemente uma pequena dobra de pele de rato. Use pomada veterinária nos olhos para evitar ressecamento durante a anestesia.
nota: Se nenhum movimento for observado, o animal é suficientemente anestesiado para iniciar os experimentos.
- Injete as células por via subcutânea nos flancos esquerdos de camundongos machos nus BALB/C (6 a 7 semanas de idade, 20 a 22 g).
- Continue observando os ratos até que eles comecem a se movimentar pela gaiola.
nota: Não deixe um animal sozinho até que ele tenha recuperado a consciência suficiente para manter a decúbito esternal. Não devolva um animal que tenha sido submetido a cirurgia à companhia de outros animais até que ele esteja totalmente recuperado. Mantenha os camundongos em condições específicas livres de patógenos (FPS).
- Meça o tamanho do tumor com paquímetros todos os dias. Calcule o volume do tumor (mm3) como (comprimento × largura2) / 2. Quando o tamanho do tumor atingir aproximadamente 200 mm3 de volume, inicie o experimento.
- Estudo de eficácia anticâncer
- Divida aleatoriamente os camundongos em 4 grupos (n = 10 para cada grupo).
- Anestesiar os camundongos com uma injeção intravenosa de xilazina e uma mistura de tiletamina e zolazepam (1:2, 1 ml/kg). Confirme a anestesia adequada beliscando suavemente uma pequena dobra de pele de rato. Use pomada veterinária nos olhos para evitar ressecamento durante a anestesia.
nota: Se nenhum movimento for observado, o animal é suficientemente anestesiado para iniciar os experimentos.
- Dissolver as nanopartículas em PBS até uma concentração final de 2 mg/ml HB. Injete PBS, HB livre, HB-NPs ou HB-P-NPs através da veia da cauda (2 mg / kg como HB) duas vezes nos dias 0 e 7.
- Continue observando os ratos até que eles comecem a se movimentar pela gaiola.
nota: Não deixe um animal sozinho até que ele tenha recuperado a consciência suficiente para manter a decúbito esternal. Não devolva um animal que tenha sido submetido a cirurgia à companhia de outros animais até que esteja totalmente recuperado. Mantenha as gaiolas escuras e sob condições específicas de FPS.
- 24 horas após cada injeção, anestesiar os camundongos com uma injeção intravenosa de xilazina e uma mistura de tiletamina e zolazepam (1:2, 1 ml/kg). Confirme a anestesia adequada beliscando suavemente uma pequena dobra de pele de rato. Use pomada veterinária nos olhos para evitar ressecamento durante a anestesia.
nota: Se nenhum movimento for observado, o animal é suficientemente anestesiado para iniciar os experimentos.
- Coloque o local do tumor sob a fibra da TFD (com 1 cm de distância da fibra da TFD ao tumor). Use óculos de segurança a laser, desligue o interruptor e ilumine o tumor com um laser PDT (630 nm, 400 mW / cm2) por 500 segundos (200 J / cm2) duas vezes nos dias 1 e 8.
- Continue observando os ratos até que eles comecem a se mover pela gaiola. Não deixe um animal sozinho até que ele tenha recuperado a consciência suficiente para manter a decúbito esternal. Não devolva um animal que tenha sido submetido a cirurgia à companhia de outros animais até que esteja totalmente recuperado.
- Mantenha as gaiolas em condições de FPS. Mantenha as gaiolas no escuro por 24 horas após o tratamento a laser.
- Monitore visualmente o volume do tumor e as mudanças no local do tumor todos os dias. Meça o tamanho do tumor com paquímetros e calcule o volume como (comprimento × largura2) / 2 (mm3). Tire fotos dos locais do tumor todos os dias para verificar se há alterações na superfície do tumor após a PDT.
- No dia 16, sacrifique cinco camundongos por grupo por anestesia terminal usando isoflurano.
- Com fórceps e tesoura, corte a pele externa e exponha os tumores. Colha-os com cuidado. Fixe-os em formol a 10%, embeba-os em parafina e core-os com hematoxilina e eosina (H&E) para a análise histológica.
- Após 45 dias de monitoramento, sacrifique os camundongos restantes por anestesia terminal usando isoflurano.