Instilação e fixação pulmonar: introdução de líquido na traqueia e fixação dos pulmões para medir o volume pulmonar fixo

Resumo

Fonte: Limjunyawong, N. et al, Métodos de instilação e fixação úteis na pesquisa do câncer de pulmão em camundongos. J. Vis. (2015).

Este vídeo descreve um método simples e confiável de introdução de líquido na traqueia para instilação, fixação e medição do volume pulmonar.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária do JoVE.

1. Instilação pulmonar

1. Selecione uma cânula intravenosa comercial de 20 g de uma polegada de comprimento para usar na intubação.
2. Modifique a ponta do cateter dobrando-a manualmente para gerar uma ligeira curvatura na ponta, conforme ilustrado na Figura 1.
3. Anestesiar o camundongo com uma mistura de cetamina (100 mg/kg) e xilazina (15 mg/kg) injetada IP, e confirmar a anestesia pela ausência de movimento reflexo. Aplique pomada veterinária nos olhos imediatamente após a anestesia. Imediatamente após a anestesia, aplique pomada veterinária nos olhos e administre carprofeno (5-10 mg / kg SQ) para analgesia pós-cirúrgica e de instilação.
4. Coloque o rato em decúbito dorsal em uma plataforma inclinada. Conforme mostrado na Figura 2, um grande fichário de escritório com alças de sutura coladas funciona perfeitamente bem.
5. Raspe a parte ventral do pescoço e limpe e desinfete a área do pescoço com álcool 70%. Com luvas novas sem látex e pó, use instrumentos cirúrgicos desinfetados com álcool 70%.
6. Usando uma tesoura afiada, faça uma pequena incisão cirúrgica no pescoço aproximadamente 12 mm abaixo do incisivo inferior.
7. Com uma pinça, puxe suavemente a pele do pescoço caudalmente até que a parede ventral da traqueia possa ser vista.
8. Retraia suavemente a língua e insira a cânula com a ponta dobrada inclinada em direção à superfície ventral do mouse. Como em 1.4, puxe suavemente a pele do pescoço e insira a cânula na traquéia.
   nota: Com um pouco de prática, o cateter ficará visível descendo pela traqueia. Se for para o esôfago, não haverá visão visual do movimento do cateter. Nenhuma incisão é feita na traqueia.
9. Uma vez que o cateter é visto na traqueia no pescoço, avançou-o cerca de 5 mm para passar de forma confiável pelas cordas vocais, mas ainda bem acima da carina.
10. Prepare-se para instilar até 50 μl de líquido injetando através do cateter com uma ponta de pipeta de carregamento de gel. Coloque a ponta no cubo luer, mas antes de injetar olhe com cuidado para observar o movimento do fluido na ponta em sincronia com a respiração do mouse. Em seguida, injete o destilado.
11. Com uma seringa de 1 ml, faça imediatamente uma inflação relativamente rápida de 0,6 ml de ar nos pulmões através do cateter para ajudar a distribuir o líquido profundamente nos pulmões. Remova a cânula.
12. Remova a cânula.
13. Use uma pequena quantidade de adesivo de cianoacrilato para fechar a pequena ferida cirúrgica de acordo com as instruções da bula do VetBond. Coloque os ratos em gaiolas individuais e monitore-os visualmente até que acordem e se comportem normalmente, sem qualquer indicação de desconforto.

2. Medição do Volume Pulmonar Fixo

1. Meça o volume pulmonar usando o princípio de Arquimedes, conforme ilustrado na Figura 3. Remova o pulmão fixo do formaldeído e disseque o coração e qualquer outro tecido não pulmonar.
2. Use um dispositivo de suporte de fio caseiro simples previamente construído que é usado para manter os pulmões totalmente debaixo d'água.
   nota: Este dispositivo precisa ser compatível com qualquer balança que esteja sendo usada. Um dispositivo típico mostrado na Figura 4 é feito de pipetas de plástico e fio fino (20 G). Este sistema funciona bem com a balança usada no vídeo, mas pode ser facilmente adaptado à maioria das balanças de laboratório.
3. Coloque um copo com ≈200 ml de água na balança e tara com a gaiola de suporte colocada na água. Veja a Figura 5. Remova a gaiola de metal; Coloque o pulmão na superfície da água e pressione sob a água com a gaiola.
4. Registre o peso na balança. Esse número reflete o volume de água deslocado e, portanto, é uma medida direta do volume pulmonar. Tenha cuidado para garantir que o pulmão ou sutura ou qualquer parte da gaiola de arame não toque nas laterais ou na parte inferior do copo.
5. Para precisão, repita esta medição. Remova o pulmão da água e seque em um lenço de papel. Tara novamente o copo com a gaiola colocada e repita a medição do volume pulmonar. As duas medições de volume devem então ser calculadas em média.
   nota: Se os pulmões forem deixados na formalina por mais de uma semana, o ar nos pulmões será dissolvido no líquido. Quando isso acontece, o pulmão afunda, então não é mais necessário usar nenhum dispositivo como na Figura 4 para manter o pulmão submerso. Nesse caso, o volume pode ser medido simplesmente segurando o pulmão por uma das cordas de sutura até que esteja completamente submerso, conforme ilustrado na Figura 3.

Resultados

Figura 1: Cateter intravenoso com ponta levemente curvada utilizado para instilação.

Figura 2: Fichário inclinado de 3 anéis usado para apoiar camundongos para a intubação. Este fichário configurado para conter 3 ratos...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Balança de Laboratório	Ohaus	Aventureiro Pro Modelo AV 313	Outras balanças podem ser usadas se tiverem uma faixa de 1-300 g
Cateter intravenoso Luer de 20 g	Insylte		Vários outros fornecedores possíveis, por exemplo, Jelco Optiva
Frasco de laboratório de 500 ml	vário		Vários outros fornecedores possíveis