Enxertia de ilhotas pancreáticas: um método para implantar ilhotas pancreáticas na câmara anterior do olho do camundongo para imagens in vivo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária jove

1. Preparação do equipamento de transplante e mesa cirúrgica

NOTA: Todas as ferramentas cirúrgicas devem ser autoclavadas e a mesa cirúrgica e os instrumentos desinfetados com álcool 70%.

1. Conecte um suporte de cabeça estereotáxico à anestesia por meio de uma máscara nasal e ligue a almofada de aquecimento.
2. Conecte uma seringa Hamilton estanque a um tubo de polietileno e uma cânula de olhal de extremidade romba.
   nota: Recomenda-se preencher todas as peças com PBS antes da montagem. Verifique se há bolhas de ar presas e remova-as se houver.
3. Encaixe a seringa de Hamilton firmemente na mesa (Figura 1a) ou em uma base móvel (Figura 1e) e conecte o tubo ao microscópio estéreo, com a cânula pendurada (ou seja, posição de espera).
   nota: Use fita cirúrgica, pois é fácil de remover e recolocar.
4. Prepare uma seringa de 1 ml ligada a uma agulha de 30 G cheia de solução de buprenorfina a 0,1 mg/kg.
5. Prepare uma seringa com PBS estéril. Como alternativa, use uma pipeta.
6. Separe uma gaiola de despertar limpa com uma lâmpada de aquecimento.

2. Anestesia e posicionamento de camundongos receptores para cirurgia

NOTA: Todos os animais foram criados e mantidos em um ambiente livre de patógenos nas instalações de animais da Universidade de Lund.

1. Anestesiar o camundongo em uma câmara preenchida com 40% O₂/60% N₂/3% isoflurano e transferir o camundongo anestesiado para a plataforma do suporte da cabeça em uma almofada de aquecimento quente (Figura 1a). Verifique a falta de reflexos nos pedais.
   nota: A anestesia com isoflurano é o método preferido de anestesia para recuperação rápida após a cirurgia. A sala do microscópio deve ser devidamente ventilada para usar isoflurano.
2. Coloque o focinho do mouse na máscara de anestesia conectada à máquina de anestesia com isoflurano 40% O₂ / 60% N₂ 0,9% –1,5%. Use o polegar e o dedo para levantar ligeiramente a cabeça e prenda-a usando as peças metálicas nas laterais. Certifique-se de que os fones de ouvido fixem a cabeça diretamente abaixo das orelhas. Injete 0,1 mg / kg de solução de buprenorfina por via subcutânea nas costas do camundongo.
   nota: A buprenorfina é usada como analgésico.
3. Incline a cabeça para que o olho a ser operado fique voltado para cima e próximo ao pesquisador.
4. Retraia suavemente as pálpebras do olho a ser transplantado usando uma pinça romba, retire o olho e fixe frouxamente com uma pinça. Certifique-se de que as pontas das pinças estejam cobertas com um tubo de polietileno preso à plataforma do suporte da cabeça (Figura 1a, inserção).
5. Sempre mantenha os dois olhos molhados aplicando uma gota de PBS estéril no olho.
6. Transfira as ilhotas humanas do tubo selado de 1,5 mL (seção 1) para uma placa de Petri com PBS estéril e certifique-se de que as ilhotas estejam próximas umas das outras para minimizar a quantidade de meios de cultura de células transferidos (Figura 1c).
7. Pegue ~ 20–30 ilhotas na cânula ocular conectada via tubo de polietileno à seringa Hamilton.
   nota: Pegue o mínimo de líquido possível com as ilhotas.
8. Pendure o tubo de cabeça para baixo e conecte-o ao microscópio estéreo (Figura 1d). Prenda o tubo com fita adesiva com cuidado para permitir que as ilhotas afundem até o final do tubo em direção à cânula.

3. Procedimento de transplante

NOTA: Este método foi descrito anteriormente para o transplante de ilhotas de camundongos. Um procedimento ligeiramente modificado é apresentado aqui.

1. Aperte as almofadas nas patas traseiras para se certificar de que o mouse está dormindo.
2. Aperte a pinça que restringe o olho sem interromper o fluxo sanguíneo e aplique uma gota de PBS estéril no olho.
3. Usando uma agulha de 25 G como bisturi, chanfre para cima, penetre cuidadosamente apenas metade da ponta na córnea e faça uma única incisão lateral. Faça o furo em um ângulo para cima; o orifício selará mais facilmente após o transplante (Figura 1f).
4. Levante cuidadosamente a córnea com a cânula pré-carregada com ilhotas e aplique lentamente ilhotas no olho. Evite a inserção da cânula na câmara anterior para evitar danos à íris, mas empurre cuidadosamente contra a abertura da córnea (Figura 1g). Retraia lentamente a cânula da ECA
   nota: Apontar para um volume de injeção de 3–8 μL. Se o volume for muito grande, ele exporá o olho a uma pressão intraocular desnecessariamente alta e poderá resultar em refluxo das ilhotas injetadas para fora da câmara anterior.
5. Ao enfrentar dificuldades com a inserção das ilhotas devido ao aumento da pressão na câmara ocular, amplie o local da incisão reforçando o local da incisão lateral e reaplique as ilhotas.
   nota: Ocasionalmente, bolhas de ar introduzidas podem ser usadas como suportes de espaço.
6. Aplique gel ocular no olho, afrouxe a pinça de contenção ocular e deixe o camundongo tomar isoflurano na mesma posição por 8 a 10 minutos para deixar as ilhotas endurecerem.
7. Remova a pinça que segura a pálpebra e coloque a pálpebra de volta à sua posição normal.
8. Remova o mouse do suporte de cabeça e transfira-o para uma gaiola de despertar.
9. Quando o rato estiver acordado e em movimento, transfira-o de volta para a gaiola original e mantenha-o no alojamento do animal até a digitalização (recomenda-se pelo menos 5 dias).

Figura 1: Transplante de ilhotas pancreáticas para a câmara anterior do olho.
(a) Configuração do transplante mostrando camundongo anestesiado fixado no suporte de cabeça estereotáxico e o olho exposto (inserção) ao lado da seringa Hamilton preparada fixada à mesa e o estereomicroscópio pronto para pegar ilhotas de camundongo (b) ou ilhotas humanas (c). d) Posição de espera da cânula ocular carregada com ilhotas. (e) Transplante em processo, e (f) desenho esquemático de uma única incisão lateral usada para levantar cuidadosamente a córnea com a ponta da cânula ocular e dispensar ilhotas na câmara anterior (g). Imagem do olho imediatamente após a injeção de ilhotas de camundongo (h) ou ilhotas humanas (i). Barra de escala = 500 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.