Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária jove
1. Preparação do equipamento de transplante e mesa cirúrgica
NOTA: Todas as ferramentas cirúrgicas devem ser autoclavadas e a mesa cirúrgica e os instrumentos desinfetados com álcool 70%.
- Conecte um suporte de cabeça estereotáxico à anestesia por meio de uma máscara nasal e ligue a almofada de aquecimento.
- Conecte uma seringa Hamilton estanque a um tubo de polietileno e uma cânula de olhal de extremidade romba.
nota: Recomenda-se preencher todas as peças com PBS antes da montagem. Verifique se há bolhas de ar presas e remova-as se houver.
- Encaixe a seringa de Hamilton firmemente na mesa (Figura 1a) ou em uma base móvel (Figura 1e) e conecte o tubo ao microscópio estéreo, com a cânula pendurada (ou seja, posição de espera).
nota: Use fita cirúrgica, pois é fácil de remover e recolocar.
- Prepare uma seringa de 1 ml ligada a uma agulha de 30 G cheia de solução de buprenorfina a 0,1 mg/kg.
- Prepare uma seringa com PBS estéril. Como alternativa, use uma pipeta.
- Separe uma gaiola de despertar limpa com uma lâmpada de aquecimento.
2. Anestesia e posicionamento de camundongos receptores para cirurgia
NOTA: Todos os animais foram criados e mantidos em um ambiente livre de patógenos nas instalações de animais da Universidade de Lund.
- Anestesiar o camundongo em uma câmara preenchida com 40% O2/60% N2/3% isoflurano e transferir o camundongo anestesiado para a plataforma do suporte da cabeça em uma almofada de aquecimento quente (Figura 1a). Verifique a falta de reflexos nos pedais.
nota: A anestesia com isoflurano é o método preferido de anestesia para recuperação rápida após a cirurgia. A sala do microscópio deve ser devidamente ventilada para usar isoflurano.
- Coloque o focinho do mouse na máscara de anestesia conectada à máquina de anestesia com isoflurano 40% O2 / 60% N2 0,9% –1,5%. Use o polegar e o dedo para levantar ligeiramente a cabeça e prenda-a usando as peças metálicas nas laterais. Certifique-se de que os fones de ouvido fixem a cabeça diretamente abaixo das orelhas. Injete 0,1 mg / kg de solução de buprenorfina por via subcutânea nas costas do camundongo.
nota: A buprenorfina é usada como analgésico.
- Incline a cabeça para que o olho a ser operado fique voltado para cima e próximo ao pesquisador.
- Retraia suavemente as pálpebras do olho a ser transplantado usando uma pinça romba, retire o olho e fixe frouxamente com uma pinça. Certifique-se de que as pontas das pinças estejam cobertas com um tubo de polietileno preso à plataforma do suporte da cabeça (Figura 1a, inserção).
- Sempre mantenha os dois olhos molhados aplicando uma gota de PBS estéril no olho.
- Transfira as ilhotas humanas do tubo selado de 1,5 mL (seção 1) para uma placa de Petri com PBS estéril e certifique-se de que as ilhotas estejam próximas umas das outras para minimizar a quantidade de meios de cultura de células transferidos (Figura 1c).
- Pegue ~ 20–30 ilhotas na cânula ocular conectada via tubo de polietileno à seringa Hamilton.
nota: Pegue o mínimo de líquido possível com as ilhotas.
- Pendure o tubo de cabeça para baixo e conecte-o ao microscópio estéreo (Figura 1d). Prenda o tubo com fita adesiva com cuidado para permitir que as ilhotas afundem até o final do tubo em direção à cânula.
3. Procedimento de transplante
NOTA: Este método foi descrito anteriormente para o transplante de ilhotas de camundongos. Um procedimento ligeiramente modificado é apresentado aqui.
- Aperte as almofadas nas patas traseiras para se certificar de que o mouse está dormindo.
- Aperte a pinça que restringe o olho sem interromper o fluxo sanguíneo e aplique uma gota de PBS estéril no olho.
- Usando uma agulha de 25 G como bisturi, chanfre para cima, penetre cuidadosamente apenas metade da ponta na córnea e faça uma única incisão lateral. Faça o furo em um ângulo para cima; o orifício selará mais facilmente após o transplante (Figura 1f).
- Levante cuidadosamente a córnea com a cânula pré-carregada com ilhotas e aplique lentamente ilhotas no olho. Evite a inserção da cânula na câmara anterior para evitar danos à íris, mas empurre cuidadosamente contra a abertura da córnea (Figura 1g). Retraia lentamente a cânula da ECA
nota: Apontar para um volume de injeção de 3–8 μL. Se o volume for muito grande, ele exporá o olho a uma pressão intraocular desnecessariamente alta e poderá resultar em refluxo das ilhotas injetadas para fora da câmara anterior.
- Ao enfrentar dificuldades com a inserção das ilhotas devido ao aumento da pressão na câmara ocular, amplie o local da incisão reforçando o local da incisão lateral e reaplique as ilhotas.
nota: Ocasionalmente, bolhas de ar introduzidas podem ser usadas como suportes de espaço.
- Aplique gel ocular no olho, afrouxe a pinça de contenção ocular e deixe o camundongo tomar isoflurano na mesma posição por 8 a 10 minutos para deixar as ilhotas endurecerem.
- Remova a pinça que segura a pálpebra e coloque a pálpebra de volta à sua posição normal.
- Remova o mouse do suporte de cabeça e transfira-o para uma gaiola de despertar.
- Quando o rato estiver acordado e em movimento, transfira-o de volta para a gaiola original e mantenha-o no alojamento do animal até a digitalização (recomenda-se pelo menos 5 dias).
