Eletroporação de Organoides: Um Método para Transfectar DNA de Plasmídeo em Organoides Gastrointestinais

Resumo

Fonte: Gaebler, A. M.et al.Protocolo de Eletroporação Universal e Eficiente para Engenharia Genética de Organoides Gastrointestinais. J. Vis. Exp. (2020).

Este vídeo descreve o protocolo de eletroporação para transfecção de grandes plasmídeos em organoides gastrointestinais tridimensionais para comprovar sua funcionalidade universal em diferentes entidades, ou seja, adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC), câncer colorretal (CRC), colangiocarcinoma (CCC) e organoides de câncer gástrico (GC).

Protocolo

1. Cultura de organoides e preparações antes da eletroporação

1. Estabeleça organoides por digestão de tecidos, conforme descrito anteriormente, e expanda-os com seu meio de cultura específico da entidade correspondente em uma visão geral da matriz do embasamento, consulte a Tabela 1 e a Tabela de Materiais
   nota: Para amostras de tecido humano, é necessário o consentimento informado e a aprovação do estudo por um comitê de ética.
2. Pré-aqueça placas de 48 poços a 37 °C para semeadura pós-eletroporação.
3. Prepare meio basal sem antibióticos, bem como meio de cultura organoide específico da entidade sem antibióticos (ver Tabela 1), incluindo 10 μM Y-27632 e 3 μM CHIR99021.
   nota: A retirada de antibióticos é importante para reduzir os efeitos tóxicos. Y-27632 e CHIR99021 melhorar a recuperação celular.
4. Preparação dos organoides (ver figura 1)
   1. Cultivar 5 poços de organoides em uma placa de 48 poços por amostra de eletroporação em meio de cultura.
      nota: Organoides proliferativos devem ser usados (cerca de 2-3 dias após a última divisão).
   2. Prepare 230 μL de reagente de dissociação (consulte a Tabela de Materiais), incluindo 10 μM de Y-27632 por poço.
   3. Remover o meio de cultura de cada alvéolo e dissociar mecanicamente os organoides em 230 μL da mistura de dissociação preparada. Agrupe 5 poços por amostra de eletroporação em um tubo de 15 mL.
   4. Misturar por vórtice e incubar durante 5-15 min a 37 °C até ocorrerem aglomerados de 10-15 células. Portanto, verifique a dissociação microscopicamente. Pare a digestão adicionando meio basal sem antibióticos até 10 mL.
      nota: Esta etapa é muito crítica! A eficiência da eletroporação será reduzida, quando a incubação for muito curta, mas a digestão longa reduzirá a capacidade de sobrevivência.
   5. Centrifugue a 450 x g por 5 min à temperatura ambiente, descarte o sobrenadante e lave duas vezes com 4 mL de tampão de eletroporação (consulte a Tabela de Materiais).

2. Eletroporação

NOTA: O protocolo a seguir foi desenvolvido para eletroporadores capazes de ondas quadradas e sequências de pulso de poring e transferência separadas (consulte a Figura 2). Opcionalmente, os valores de impedância, bem como as tensões, correntes e energias transferidas para a amostra, podem ser medidos como controle para experimentos reprodutíveis.

1. Ressuspenda o sedimento organoide em 100 μL de tampão de eletroporação (ver Tabela de Materiais) contendo 30 μg de DNA plasmidial.
   nota: A concentração do DNA do plasmídeo usado deve exceder 5 μg/μL para uma concentração ideal de sal durante o processo de eletroporação. Portanto, são recomendados maxi kits de plasmídeo endofree (ver Tabela de Materiais) para a preparação de vetores. Uma quantidade total de até 45 μg de DNA pode ser usada sem efeitos citotóxicos.
2. Dispensar a mistura completa de ADN-organoide para uma cubeta de electroporação com 2 mm de largura sem produzir bolhas de ar.
3. Defina os parâmetros de eletroporação (consulte a Tabela 2, Figura 2).
4. Misture as células ligeiramente sem espumar batendo na cubeta com um dedo. Coloque a cubeta na câmara da cubeta.
5. Pressione o botão Ω do eletroporador e anote o valor da impedância.
   nota: Uma impedância entre 30-40 Ω apresentou os melhores resultados. Em geral, deve estar na faixa entre 30-55 Ω. Se este não for o caso, controle os seguintes aspectos: largura da folga da cubeta usada, conexões de cabos do eletroporador, possíveis bolhas de ar, volume correto e concentração de sal da mistura de eletroporação.
6. Pressione o botão Iniciar para executar o programa de eletroporação e controlar os valores de correntes, tensões e energias exibidos.
   nota: Os valores das tensões medidas, correntes e energias devem corresponder aos parâmetros de eletroporação definidos. Para a comparação de experimentos repetidos, pode ser útil observar esses dados.
7. Após a eletroporação, adicione imediatamente 500 μL de meio de cultura sem antibióticos (com CHIR99021 e Y-27632; consulte a etapa 1.3). Misture pipetando para cima e para baixo para dissociar a espuma branca.
   nota: A espuma branca aparece após o processo de eletroporação e um número significativo de células é anexado a ela. Portanto, a dissociação dele é muito importante para não perder células.
8. Transferir a amostra completamente da cubeta para um novo tubo de 15 ml utilizando a pipeta pertencente às cubetas de electroporação (ver Tabela de Materiais). Recomenda-se enxaguar a cubeta novamente com meio basal para obter as células restantes.
9. Para regeneração das células, incube-as por 40 min em temperatura ambiente.

3. Semeadura de células

1. Centrifugue as células a 450 x g por 5 min em temperatura ambiente e descarte o sobrenadante.
2. Ressuspenda o pellet em 100 μL de matriz basal e semeie gotas de 20 μL em uma placa pré-aquecida de 48 poços (consulte a etapa 1.2). Incubar por 10 min a 37 °C para polimerização e adicionar 250 μL de meio de cultura, que é suplementado com Y-27632 e CHIR99021 até a próxima divisão dos organoides cultivados (cerca de 5-7 dias).

4. Determinação da Eficiência de Transfecção

NOTA: Em geral, recomenda-se eletroporar um vetor carregando um marcador de fluorescência como controle adicional de transfecção. Dependendo do marcador escolhido e da maturação de seu cromóforo, a fluorescência será visível em torno de 24-48 h após a transfecção 18 .

1. Verificar a fluorescência microscopicamente após 24-48 h no controlo de transfecção (Figura 3B)

Tabela 1: Composição dos meios basais, misturas de digestão e meios de cultivo.

Componentes do meio basal:	eu	Ii
DMEM/F-12 avançado	-	-
Glutamamax	1x	1x
Hepes	10 mM	10 mM
Penicilina estreptomicina	-	1x
Primocin	1x	-

Estabelecimento por digestão
Mistura de digestão:	dois pontos		Estômago		Fígado		Pâncreas
	normal	tumoral	normal	tumoral	normal	tumoral	normal	tumoral
Colagenase II	-	-	-	-	-		0,625 mg/ml
Colagenase XI	-	0,1 mg/ml	-	0,1 mg/ml	-		-
Colagenase D	-	-	-	-	2,5 mg/ml		-
Dissipação II	-	1 mg/ml	-	1 mg/ml	-		2,5 mg/ml
DNase I	-	-	-	-	0,1 mg/ml		-
Edta	2mM	-	10mM	-	-		-
Diluído em	Tampão quelante*	Meio basal I	Tampão quelante*	Meio basal I	em EBSS		Meio basal I
Incubação para:	0,5 h no gelo	1h a 37°C	0.25-0.5 h em RT	1h a 37°C	0,5-1 h às 37°C	1,5 h a 37 °C	0,5-1 a 37 ° C	2-3 h a 37°C
Adaptado da referência:	Sato et al. 2011		Bartfeld et al. 2015		Broutier et al. 2016		Hennig et al. 2019

Meio de cultivo (Básico: Meio basal II)
A83-01	0,5 μM	2 μM	5 μM	0,5 μM
B27	1x	1x	1x	1x
B27 sem vitamina A	-	-	1x	-
Forscolina	-	-	10 μM	-
hFGF-10	-	200 ng/ml	100 ng/ml	100 ng/ml
hHGF	-	-	25 ng/ml	-
[Leu15] Gastrina	10 nM	1 nM	10 nM	10 nM
mEGF	50 ng/ml	50 ng/ml	50 ng/ml	50 ng/ml
N2	-	-	1x	-	1x
N-Acetil-L-cisteína	1,25 mM	1 mM	1 mM	1 mM
Nicotinamida	10 mM	10 mM	10 mM	10 mM
Cabeça	10 %	10 %	-	10 %
Primocin	1x (100 μg/ml)	1x (100 μg/ml)	1x (100 μg/ml)	1x (100 μg/ml)
Prostaglandina E2	10 nM	-	-	-	1 μM
Rspondin	20 %	10 %	10 %	10 %
SB202190	3μM	-	-	-
Wnt3A	50 %	50 %	-	50 %
*Tampão quelante: 5,6 mM Na2HPO4, 8,0 mM KH2PO4, 96,2 mM NaCl, 1,6 mM KCl, 43,4 mM sacarose, 54,9 mM d-sorbitol, 0,5 mM dl-ditiotreitol em água destilada

Resultados

Figura 1: Fluxo de trabalho de preparação de eletroporação. Primeiro, os organoides devem ser dissociados em grupos de 10 a 15 células e os antibióticos devem ser eliminados. Após a eletroporação, a espuma branca prec...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
[Leu15] Gastrina	Sigma-Aldrich	G9145
A83-01	Tocris Biociência	Nº 2939
DMEM/F-12 avançado	Invitrogen	12634010
B27	Invitrogen	17504044
Suplemento B27, menos vitamina A	Thermo Fisher Científico	12587010
CHIR99021	Stemgent	04-2004
Colagenase II	Tecnologias da Vida	17101-015
Colagenase XI	Sigma-Aldrich	C9407-100MG
Colagenase D	Roche	11088866001
Dissipação II	Roche	4942078001
Dnase I	Sigma-Aldrich	D5319
D-sorbitol	Roth	Nº 6213.1
Ditiotreitol	Thermo Científico	1859330
Edta	Roth	8040
Forscolina	Tocris Biociência	1099
Glutamamax	Tecnologias da Vida	35050061
Hepes	Thermo Fisher Científico	15630106
hFGF-10	Pré-tecnologia	100-26
Kcl	Sigma-Aldrich	Pág. 9541
KH2PO4	Roth	3904.2
Matrigel	Corning	356231	matriz do porão
mEGF	Invitrogen	PMG8043
N2	Invitrogen	17502048
NaCl	Roth	3957.1
Na2HPO4	Roth	K300.2
N-acetil-L-cisteína	Sigma-Aldrich	Rolamento A9165
Nicotinamida	Sigma-Aldrich	N0636
Cabeça	n.a.	n.a.	Meio condicionado produzido a partir de células HEK293 (Hek293- mNoggin-Fc)
HGF humano recombinante	Pré-tecnologia	100-39H
Rspondin	n.a.	n.a.	Meio condicionado produzido a partir de células HEK293 (HA-Rspo1- Fc-293T)
SB202190	Sigma-Aldrich	S7067
TrypLE Express	Gibco	12604021	Reagente de dissociação
Wnt3A	n.a.	n.a.	Meio condicionado produzido a partir de células L-Wnt3a (de Sylvia Boj)
Y-27632	Sigma-Aldrich	Y0503
Placa de 48 poços	Corning	3548
Cuvetes de Eletroporação Nepa 2mm com folga com pipetas	Nepa Gene Co., Ltd.	EC-002S
Eletroporador Nepa21	Nepa Gene Co., Ltd.	n.a.
EVOS FL Auto	Invitrogen	AMAFD1000	Microscópio de fluorescência
EndoFree Plasmídeo Maxi Ki	Qiagen	Rolamento 12362
Opti-MEM	Gibco	31985047	Tampão de eletroporação
2 vetor concatemer de gRNA	AddGene	Rolamento 84879
plasmídeo px458	AddGene	Rolamento 48138	codificação para sgRNA e Cas9
px458_Conc2 plasmídeo	AddGene	134449	plasmídeo px458 contendo 2x promotores U6 para dois sgRNAs diferentes